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《南京农业大学》 2003年
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鸡胚致死孤儿病毒的分离鉴定及其Ⅲa蛋白的原核表达与抗原性分析

周斌  
【摘要】: 鸭病毒性肝炎病毒(E52株)在增殖病毒的过程中,运用非免疫鸡胚进行传毒,致使种毒受到污染。应用聚乙二醇-Sephadex G100柱层析-透析法纯化了污染病毒,电镜下观察到大小为70~80nm,无囊膜,20面体对称的病毒颗粒,符合腺病毒的形态学特征。 挑选了4条随机引物对此未知病毒分别进行反转录PCR和直接PCR扩增,结果共扩增出3条基因片段,经测序(一个反应)后分析与禽腺病毒1型——鸡胚致死孤儿病毒基因组部分序列6683bp~7245bp,41507bp~42060bp和40772bp~41212bp同源性分别高达99.5%、99.6%和99.5%。从而得知鸡胚致死孤儿病毒严重污染了鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒。 根据GenBank上已公布的鸡胚孤儿致死病毒(CELOV)Ⅲa蛋白核酸序列,自行设计一对引物。SDS-蛋白酶K法提取病毒DNA作为PCR扩增模板,PCR扩增到1728bp的特异性条带。将其克隆入pGEM-T Easy载体中,经测序验证为CELOV Ⅲa蛋白基因,再亚克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建成Ⅲa蛋白原核表达载体pETⅢa。 用已构建好的表达鸡胚致死孤儿病毒Ⅲa蛋白的原核表达载体pETⅢa转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆培养,IPTG诱导后裂解菌体作SDS-PAGE,出现大小约76KD的表达产物,经Western blot验证重组蛋白具有CELOV抗原性。但背景不清,存在非特异性,因此将表达蛋白长程免疫小白鼠获得抗Ⅲa蛋白的抗血清。间接免疫荧光实验(IFA)鉴定抗血清的活性,从而间接证明蛋白产物具有抗原性。为建立ELISA快速诊断试剂盒的研究奠定基础。 通过摸索不同诱导条件、不同诱导所需IPTG浓度,优化了Ⅲa蛋白的表达条件:30℃培养待菌生长至OD600为0.4-0.6时,用终浓度为0.2mM的IPTG诱导,37℃震荡培养4-5h。表达产量高,经薄层扫描表达量约为33%,且不以包涵体的形式存在。宿主菌经超声波破碎后离心,融合蛋白存在于裂解上清中,螯和亲和层析纯化了融合蛋白,并将其冻干保存备做检测抗原。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
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1 韦悠;谢芝勋;范晴;刘加波;谢丽基;庞耀珊;邓显文;谢志勤;;禽Ⅰ群腺病毒血清1型株灭活疫苗的研制[J];动物医学进展;2011年11期
2 韦悠;谢芝勋;刘加波;谢丽基;庞耀珊;邓显文;谢志勤;;禽腺病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立[J];畜牧与兽医;2011年10期
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1 韦悠;Ⅰ群禽腺病毒灭活油乳剂苗的研究[D];广西大学;2011年
2 向斌;葡萄卷叶相关病毒2中国分离物外壳蛋白基因的克隆与原核表达[D];华中农业大学;2005年
【参考文献】
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1 曾力宇,金奇,章金钢,李茂祥,姚二梅,殷震,侯云德;鸡减蛋综合征病毒(EDSV-76)末端前体蛋白的基因结构分析[J];病毒学报;1997年04期
2 蒋纪恺;原位分子杂交法检测细胞内腺病毒DNA[J];重庆医学;1994年05期
3 郑世民,刘忠贵,葛铭,杨丽萍;感染鸡传染性贫血病毒雏鸡新城疫疫苗免疫后免疫器官组织的抗体生成细胞数量的动态变化[J];动物医学进展;1999年03期
4 杨继红,李宁宁,唐力,何浩;肠道腺病毒及其检测技术[J];湖北预防医学杂志;2000年02期
5 黎皓;人腺病毒载体的研究进展[J];国外医学.病毒学分册;1998年02期
6 李文辉;快速构建腺病毒载体的新方法[J];国外医学.病毒学分册;1999年04期
7 李富强;禽腺病毒鸽分离株在鸡胚原代细胞上的生长特性和血清学特征[J];国外畜牧科技;1998年06期
8 王虹,王洪斌,张艳华;禽腺病毒感染的血清学调查[J];黑龙江畜牧兽医;1994年05期
9 郑庆仁;禽用SPF疫苗的特点及其应用[J];河南畜牧兽医;2000年06期
10 周力音,王海涟,李华,刘琳,黄燕;间接免疫荧光法检测腺病毒IgM[J];临床检验杂志;1995年02期
【共引文献】
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1 刘烈刚,刘恭平,姚平,郝丽萍,杨雪峰,孙秀发,朱清华;维生素A缺乏对小鼠胚胎Hox-3.5 mRNA表达与胚胎发育关系的研究[J];癌变.畸变.突变;2003年03期
2 安兰敏,杨军,徐兵;铅对大鼠脑细胞凋亡的诱发作用及对P53基因表达影响的研究[J];癌变.畸变.突变;2003年04期
3 连京华,秦卓明,黄波;鸡传染性支气管炎研究进展[J];山东农业科学;2000年01期
4 钱凤芹,刘长梅,任红梅,李爱芹,庄文忠;鸡新城疫病毒山东分离株F蛋白基因的克隆与鉴定[J];山东农业科学;2001年03期
5 吴静;李玉峰;宋敏训;黄兵;马秀丽;李峰;;鸡α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其抗病毒活性测定[J];山东农业科学;2006年01期
6 马秀丽;冯涛;于可响;王春玲;宋敏训;;几种提纯鸭病毒性肝炎血清免疫球蛋白G方法的比较[J];山东农业科学;2007年01期
7 东野传现;史玉颖;黄中利;刘玉山;亓丽红;傅剑;;“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染新城疫病毒临床效果的研究[J];山东农业科学;2007年02期
8 李子剑;李云龙;陈苏;艾武;宋敏训;李玉峰;;鸭肠炎病毒US2基因的序列测定与分析[J];山东农业科学;2008年03期
9 王欣,褚建新,傅汝林,赵钧铭;清热解毒方对可移植性小鼠淋巴细胞白血病及其微小残留病疗效的比较研究[J];中医药临床杂志;2005年02期
10 李祥辉;黄大鹏;黄玉兰;;鸡抗小鹅瘟病毒IgY提取方法的比较试验[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年23期
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1 庄金秋;梅建国;沈志强;;赤羽病病毒检测方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 庄金秋;梅建国;沈志强;;犬瘟热病毒实验室检测方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 蒋再学;陈征兵;林文;余邵华;竺薇;张晓明;罗满林;;仔猪伪狂犬PCR鉴定及病毒分离[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
4 陈宗艳;朱英奇;李传峰;李露;付玉志;王超;刘光清;;新发鸭源呼肠孤病毒(TH11株)的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
5 王珊;刘冰;李德朋;孙远;马勇;田秀丽;宋宇;王承宇;张乃生;;马蹄香治疗犬细小病毒性肠炎的疗效观察[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(下册)[C];2011年
6 李新民;党琦;;天佛参口服液(TFS)诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡及机理探讨[A];2011年中华名中医论坛暨发挥中西医优势防治肿瘤高峰论坛论文集[C];2011年
7 程晶;荫硕焱;盖新娜;郭鑫;杨汉春;;2006—2008年我国部分地区规模化猪场PRV血清流行病学调查[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
8 赵东升;盖新娜;孙栋;郭鑫;杨汉春;;猪脑心肌炎灭活疫苗的制备及小鼠免疫研究[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
9 方忠意;崔保安;;动物基因工程疫苗研究进展[A];新型疫苗研发及基因工程疫苗应用研讨会论文集[C];2010年
10 曾政;任远志;叶昭辉;凌洪权;杨泽林;熊仲良;;重庆市2009年犬狂犬病检测及流行病学调查[A];重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2009年
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1 赵冬敏;B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D];山东农业大学;2010年
2 赵鹏;猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体选择压下的变异[D];山东农业大学;2010年
3 刘栋;畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D];山东农业大学;2010年
4 张青婵;A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D];山东农业大学;2010年
5 姜中毅;猪传染性肝炎病毒的基因克隆及分子特征研究[D];甘肃农业大学;2009年
6 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
7 李彧娜;微孢根霉华根霉变种CICIM F0088生淀粉酶系的研究[D];江南大学;2010年
8 黄馨;端粒缩短影响原发性高血压及其并发症的发生[D];北京协和医学院;2010年
9 张琪;KLT对中脑神经系统疾病的影响及KLT、NDV、SW联合抗肿瘤作用机制研究[D];西北农林科技大学;2010年
10 熊义;IRES调控α-干扰素的抗FMDV研究[D];武汉大学;2009年
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1 万荣娥;S-腺苷甲硫氨酸高产菌株筛选及发酵工艺优化[D];华中农业大学;2010年
2 许媛媛;鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆[D];华中农业大学;2010年
3 李爽;鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D];华中农业大学;2010年
4 徐珊珊;重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2010年
5 胡智斌;湖北省高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)试用报告[D];华中农业大学;2010年
6 许莹;H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究[D];南京医科大学;2010年
7 辛宁;PDX-1真核表达载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达[D];郑州大学;2010年
8 王翠;杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基STT3a的基因克隆与功能分析[D];郑州大学;2010年
9 陆玉成;AMF基因在食管鳞癌细胞株中的表达及功能初步分析[D];郑州大学;2010年
10 邬成业;禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选[D];郑州大学;2010年
【同被引文献】
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1 田文会,王江柱;双链RNA分析技术在鉴定RNA病毒中的应用[J];河北农业大学学报;1995年04期
2 刘国霞,姜宇,张斌,张煜,柳絮,范仲学,钱凤芹;动物核酸疫苗研究进展[J];动物医学进展;2005年09期
3 胥传来;彭池方;郝凯;金征宇;王武康;;化学发光酶免疫法测定水产品中残留氯霉素[J];分析化学;2005年12期
4 刘崇怀,孔庆山;葡萄种质资源卷叶病毒病田间自然发病调查[J];果树科学;1998年03期
5 牛建新,李东栋;葡萄病毒病的双链RNA(dsRNA)检测技术研究[J];果树学报;2002年03期
6 王引权,古勤生,陈建军,曹孜义;葡萄病毒病研究进展[J];果树学报;2004年03期
7 舒黛廉,王慧杰,任敏;核酸疫苗研究现状[J];中国畜牧兽医;2005年10期
8 王虹,王洪斌,张艳华;禽腺病毒感染的血清学调查[J];黑龙江畜牧兽医;1994年05期
9 唐艳林;宋桂才;梁文昌;;畜禽基因工程疫苗的研究进展及应用前景[J];吉林畜牧兽医;2005年12期
10 周健,祝建新,涂应平,罗森;采用猪瘟抗体酶联免疫吸附试验检测猪瘟血清抗体[J];江西畜牧兽医杂志;2005年01期
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1 严维巍;兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的表达及其免疫原性初探[D];扬州大学;2003年
2 张明明;Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定和生物学特性研究及重组禽腺病毒的构建[D];扬州大学;2008年
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1 张亚冰;葡萄扇叶病和卷叶病的RT-PCR检测技术研究[D];西北农林科技大学;2002年
2 韩静;禽白血病p27基因的原核表达和兔抗p27抗体的制备[D];中国农业大学;2003年
3 葛菲菲;禽网状内皮组织增殖病病毒PCR及RT-PCR检测方法的研究和p30主要抗原域的原核表达[D];南京农业大学;2003年
4 黄梅清;禽(番鸭)呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究[D];福建农林大学;2006年
5 文艳玲;禽腺病毒hexon基因克隆表达及间接ELISA和荧光PCR检测方法的建立[D];广西大学;2008年
【二级引证文献】
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1 邓显文;罗思思;谢芝勋;谢丽基;刘加波;谢志勤;庞耀珊;范晴;;Ⅰ群禽腺病毒间接33K-ELISA检测方法的建立[J];南方农业学报;2012年09期
2 邓显文;谢芝勋;刘加波;谢志勤;庞耀珊;谢丽基;范晴;罗思思;;肠炎沙门菌fliC蛋白的表达及ELISA检测方法的建立[J];动物医学进展;2013年06期
3 罗思思;谢芝勋;邓显文;谢丽基;刘加波;谢志勤;庞耀珊;范晴;彭宜;;Ⅰ群禽腺病毒间接100K-ELISA检测方法的建立[J];黑龙江畜牧兽医;2013年03期
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1 杨发恒;引起我国葡萄卷叶病的四种病原病毒的RT-PCR鉴定[D];华中农业大学;2007年
【二级参考文献】
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1 张兹钧,胡木枝,金由辛;用聚合酶链反应检测产蛋下降综合症病毒核酸的研究[J];病毒学报;1996年02期
2 张兹钧,胡木枝;用生物素化重组质粒探针检测产蛋下降综合症病毒核酸[J];病毒学报;1995年02期
3 曾力宇,金奇,章金钢,李茂祥,姚二梅,殷震,侯云德;鸡减蛋综合征病毒(EDSV-76)末端前体蛋白的基因结构分析[J];病毒学报;1997年04期
4 李永明,刘英,李梅,路谨,万晴姣;贵州省产蛋下降综合症的血清学初步调查[J];贵州农业科学;1994年05期
5 钱利生;病毒粘附作用的研究现状[J];国外医学.病毒学分册;2000年01期
6 郭克泰;病毒入侵的细胞生物学机制[J];国外医学.病毒学分册;2001年05期
7 粟寿初;John K.Rosenberger;;鸡贫血因子、传染性腔上囊病病毒和禽腺病毒的某些相互作用[J];国外畜牧学(猪与禽);1992年05期
8 孔德迎,黄庚明,辛朝安;减蛋综合征病毒基因文库的构建[J];华南农业大学学报;1997年01期
9 范秀媛;张志鸿;;吉林境内发现鸡包涵体肝炎病[J];吉林畜牧兽医;1991年03期
10 段玉友,崔治中,葛天同,王永坤;产蛋下降综合症H_(91)病毒基因组DNA的酶切分析[J];江苏农学院学报;1995年03期
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1 陈溥言;禽腺病毒Ⅰ型(鸡胚致死孤儿病毒)在非免疫鸡胚中隐性感染可能已经严重危害到我国疫苗生产[J];中国家禽;2002年14期
2 ;警笛[J];畜牧兽医科技信息;2002年10期
3 刘丽;;鸡胚致死孤儿病毒的研究现状[J];畜牧兽医科技信息;2007年12期
4 王凤雪,王云峰;CELO病毒与包涵体肝炎[J];中国预防兽医学报;2005年03期
5 张知良;;禽腺病毒引起的疾病[J];畜牧兽医杂志;1985年01期
6 李俊宝;;禽腺病毒引起的疾病(综述)[J];中国家禽;1981年04期
7 ;临床医学[J];中国农业文摘(兽医);1997年03期
8 王建业,孙怀昌,朱国强;禽腺联病毒的分离及其基因组鉴定[J];扬州大学学报(农业与生命科学版);2005年02期
9 李瑞源;;鹌鹑的主要疾病一[J];养禽与禽病防治;1984年05期
10 江汉湖;朱琴亚;秦大壮;陆熬芳;;鸡鸭禽腺病毒感染的血清学检测[J];畜牧与兽医;1987年03期
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1 中国疾病预防控制中心病毒病所 孙肖红 梁国栋;病毒性脑炎病因多多[N];健康报;2005年
2 张虹河南省洛阳正骨医院;虎杖在慢性骨髓炎中的应用[N];中国中医药报;2007年
3 河北远征药业股份有限公司 杜震龙;鱼腥草[N];中国畜牧报;2004年
4 梅雨;解毒不离忍冬花[N];健康报;2003年
5 黄每裕;“解毒不离忍冬花”[N];中国医药报;2003年
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1 周斌;鸡胚致死孤儿病毒的分离鉴定及其Ⅲa蛋白的原核表达与抗原性分析[D];南京农业大学;2003年
2 王小辉;Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及其生物学特性研究[D];扬州大学;2008年
3 武敏;Ⅰ群禽腺病毒JS株Ⅲa蛋白的原核表达及其单克隆抗体的研制[D];扬州大学;2009年
4 王凤雪;CELO禽腺病毒载体的构建及fiber 1部分片段的原核表达[D];中国农业科学院;2005年
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