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《南京农业大学》 2004年
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钙信号传导途径参与稻瘟病菌生长及致病性的调控

王立安  
【摘要】:稻瘟病的控制始终是水稻生产上的一个重要问题,而控制稻瘟病菌危害的一个重要前提是要了解其致病过程。稻瘟病菌的致病过程是稻瘟病菌和水稻寄主相互识别、相互作用的过程,研究这一特异互作过程中的信号机制对深入理解稻瘟病菌的致病机理,设计新型杀菌剂,提出新的植物病害控制策略具重要意义。本论文主要研究了Ca~(2+)信号传导途径对稻瘟病菌生长及致病性的调控作用。 首先利用Ca~(2+)信号传导途径抑制剂确定了Ca~(2+)信号传导途径与稻瘟病菌生长及致病性相关。研究发现:Ca~(2+)螯合剂EGTA、Ca~(2+)通道抑制剂Verapamil、抑制磷脂酶C活性的抑制剂U-73122、影响钙调素与钙调素依赖蛋白激酶作用位点的抑制剂KN-93,随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成过程的抑制作用明显增强;同一浓度下,抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程;抑制剂影响孢子萌发和附着胞形成过程在萌发早期(1~4h)最有效;在完全被抑制、不能萌发的孢子内出现了许多颗粒状囊泡;抑制剂可使附着胞形态明显变小甚至不能形成。以上结果表明钙信号传导途径参与了稻瘟病菌孢子萌发及疏水条件下附着胞形成过程的调控。 然后对Ca~(2+)信号传导途径的关键蛋白钙调素(calmodulin CaM)对稻瘟病菌生长及致病性的调控作用进行了系统研究。通过RT-PCR克隆了稻瘟病菌的钙调素基因;序列比较表明,克隆的钙调素基因与GenBank登录的稻瘟病菌钙调素基因的序列同源性可达98.7%,与已报道的其它丝状真菌钙调素基因的同源性也在80%以上。Southern杂交分析表明,钙调素基因在稻瘟病菌基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明:钙调素基因在稻瘟病菌的菌丝中表达量最高,其次为芽管、附着胞、孢子。利用胶体金免疫电镜对钙调素在稻瘟病菌主要生长时期的细胞定位进行研究表明,钙调素在稻瘟病菌的分生孢子、芽管、液体培养菌丝、固体培养气生菌丝的细胞壁和胞质区均有分布,但芽管、液体培养菌丝细胞壁上钙调素分布明显多于胞质区。 为了研究钙调素基因对稻瘟病菌生长及致病性的调控作用,分别构建了稻瘟病菌钙调素基因敲除(同源重组替换)载体,反义、正义诱导表达载体,同时构建了用于转化系统验证的蓝色荧光蛋白(Blue Fluorescent Protein,BFP)诱导表达载体,并对它们的正确性进行了验证。 利用PEG介导的转化系统将构建好的含有潮霉素抗性筛选标记的4个载体转化到稻瘟病菌中,获得的转化子情况如下:钙调素敲除载体未获得转化子,分析原因可能是导致了致死突变;另外三种载体—钙调素反义、正义表达载体、bfp表达载体均 博士学位论文钙信号传导途径参与稻瘟病菌生长及致病性的调控 获得了潮霉素杭性转化子,这些转化子能在潮霉素抗性平皿上连续继代培养. 妙转化子的PCR验证表明转化子基因组中有bfr基因片段的整合,在奎宁酸诱 导培养基上bfr能很好表达,利用荧光显微镜可在转化子的袍子、菌丝中检测到蓝色 荧光;致病性分析表明,无论在奎宁酸诱导条件下还是在水培条件下妙转化子均表 现强致病力,表明用于钙调素基因功能研究的转化系统和启动子是可靠的. 钙调素反义、正义表达转化子的Southem杂交验证表明,转化子基因组中均有钙 调素基因片段的整合. 致病性分析表明,在奎宁酸诱导条件下,钙调素反义表达转化子表现为无致病力 或轻微致病;多数钙调素正义转化子具较强的致病力.但水培条件下钙调素反义转化 子和正义转化子多表现不致病. 在奎宁酸诱导条件下对钙调素反义转化子的生物学性状研究表明,反义转化子在 菌丝生长方面表现为菌丝恢复生长慢,袍子可以正常萌发,袍子萌发后附着胞形成率 下降到39%,许多饱子萌发后无附着胞或形成崎形附着胞,但仍有少量饱子形成正常 附着胞.正义转化子在菌丝生长、袍子萌发上与野生型无显著差异,袍子萌发后形成 正常附着胞. 在水培条件下,钙调素反义转化子多数袍子萌发后形成长芽管附着胞;还有一部 分袍子只有芽管而无附着胞或形成崎形附着胞.正义转化子萌发的袍子均可形成长芽 管附着胞. 通过本研究可以看出,钙信号传导途径对稻瘟病菌生长及致病性发挥着重要调控 作用.钙调素基因敲除后未获得转化子的原因初步I.J断为导致了致死突变,一是根据 其在稻瘟病菌基因组中为单拷贝,另外在酿酒酵母和黑曲霉的研究中有致死突变的报 道,从反面证明了钙调素基因对稻瘟病菌正常生长是必不可少的.抑制剂实验和钙调 素基因反义抑制实验均表明钙调素基因对于稻瘟病菌形成正常附着胞是重要的,表明 钙调素基因参与了稻瘟病菌性的调控.
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S435.11

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【引证文献】
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4 岑烈芳;现行人禽流感的诊疗方案有“姑息养凶”之嫌[N];健康报;2006年
5 实习记者 刘海霞;地区畜牧业良性发展[N];吐鲁番报(汉);2006年
6 冯国明;近年稻瘟病为何高发[N];湖南科技报;2007年
7 秦春娥;牛相异尿原体及其致病性[N];中国畜牧报;2004年
8 高彦生;马来西亚半岛发生高效致病性禽流感(续报6)[N];中国畜牧报;2004年
9 记者 葛进;鸡流感早期检测系统在日问世[N];科技日报;2009年
10 记者 王新丽;一些小饭店用卷筒手纸充餐纸[N];长春日报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王立安;钙信号传导途径参与稻瘟病菌生长及致病性的调控[D];南京农业大学;2004年
2 董波;稻瘟病菌MgATG9基因的克隆与功能分析[D];浙江大学;2007年
3 刘同宝;稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG4表达模式与功能分析[D];浙江大学;2008年
4 刘小红;细胞自噬与稻瘟病菌Magnaporthe grisea生长、发育和致病性的关系[D];浙江大学;2007年
5 林艳;稻瘟病菌两个新基因的功能研究[D];福建农林大学;2007年
6 郑武;稻瘟病菌Rho族GTP酶功能分析[D];福建农林大学;2006年
7 刘文德;系统分析稻瘟病菌homeobox基因的功能[D];福建农林大学;2008年
8 吕琴;稻瘟病菌mnh6和mtp1基因的克隆和功能分析[D];浙江大学;2006年
9 王教瑜;稻瘟病菌MGTA1基因的克隆与功能分析[D];浙江大学;2005年
10 方敏彦;稻瘟菌对三唑类杀菌剂丙环唑敏感性检测及农杆菌介导的稻瘟菌转化—致病缺陷突变体筛选[D];甘肃农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈晓;稻瘟病菌两个假定的Rho GTP酶激活蛋白的功能研究[D];福建农林大学;2009年
2 陈继圣;稻瘟病菌Rho族同源蛋白RAC1功能分析及相关信号途径初探[D];福建农林大学;2007年
3 杨帆;稻瘟病菌Rho2同源蛋白的功能分析[D];福建农林大学;2010年
4 樊改丽;稻瘟病菌定殖与扩展相关基因MgGLK1,MgMFS1和MgHAP的克隆与功能分析[D];福建农林大学;2011年
5 刘同宝;稻瘟病菌成熟附着胞cDNA差减文库的构建[D];浙江大学;2005年
6 张磊;稻瘟病菌相关致病基因MgATG3、MgATG4和MgATG7的克隆和功能分析[D];浙江大学;2007年
7 段志兵;稻瘟病菌MNH1和MgYCA1基因的克隆与功能分析[D];浙江大学;2007年
8 廖乾生;抗稻瘟病菌附着胞形成研究[D];浙江大学;2002年
9 陈新;稻瘟病菌两个漆酶基因功能分析[D];福建农林大学;2008年
10 刘娟;稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)致病相关基因的分子标记及克隆[D];南京农业大学;2003年
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