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《南京农业大学》 2004年 博士论文
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壳聚糖调控不结球白菜叶片氨同化关键酶作用机理初探

陈惠萍  
【摘要】: 研究了壳聚糖(chitosan,CTS)对不结球白菜叶片氨同化关键酶[谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetasc,GS)、谷氨酸合酶(glutamate2-oxoglutarate aminotransferase,即glutamate synthase,GOGAT)和谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)]和可溶性蛋白质含量的影响。结果表明,0.8mg/mL壳聚糖溶液喷洒不结球白菜叶片后,GS对NH_4~-的Km值从50mM上升到67mM,而GDH对NH_4~+的Km值则从71mM降到23mM。在酶活性检测中,发现GS活性受到了抑制,在第5天活性被抑制了31.2%。而GDH活性则被提高,尤其是在第3天和第7天,活性分别比对照提高了110%和44.3%。GOGAT活性则表现为先上升后下降。通过对同工酶酶活性染色实验结果与酶活性检测结果进行比较,发现GS和GDH的同工酶活性与检测的酶活性变化趋势一致,并且GDH同工酶中负责氨化作用的低分子量的多肽增加。进一步对酶活性的比值(GS/GDH和GS/GOGAT)进行分析表明,在壳聚糖处理后的前期,GoGAT可能与GDH-起执行氨同化作用:而在后期,氨同化作用主要是由GDH完成,GOGAT与GS组成的途径起着辅助的作用。即壳聚糖处理不结球白菜叶片后,GDH氨化能力的提高可能是叶片可溶性蛋白含量增加的主要原因。 壳聚糖(CTS)、Ca~(2+)、EGTA、异博定(Verapamikl,Vp)、LaCl_3、氯丙嗪(Chloropromalze,CPZ)和DTT、ATP等单因子及多因子结合处理不结球白菜叶片后,分别对氨同化关键酶GDH和GS的活性产生不同的影响。供给外源Ca~(2+)有利于提高GDH和Gs活性;因可以促使IP_3诱导胞内Ca~(2+)释放,DTT和ATP单因子处理也能有效地提高GDH和GS活性。而Ca~(2+)螯合剂EGTA预处理后,因螯合了部分胞外Ca~(2+),显著影响了CTS对GDH和 壳聚糖调控不结球白菜叶片氨同化关键酶作用机理初探 GS的效应,降低了GDH和GS的活性。质膜Ca’‘通道阻断剂异博定和LaC13 通过阻断质膜ca”通道而阻档胞外Ca’‘进入,使不结球白莱叶片中的GDH 和GS的活性显著下降.CaM拮抗剂氛丙漆在阻断钙信使系统后,也降低 了GDH和GS的活性。同时,CTS可以与外源Ca’‘及有利于胞质内Ca’‘浓 度上升的因子(如DTT和ATP)互作促进GDH和GS活性;而在EGTA、异 博定、LaCI,和氛丙漆分别存在下,则引起GDH和GS活性的减弱。这些 结果暗示增加[Ca’‘〕;有助于壳聚糖提高不结球白菜叶片GDH和GS的活 性,反之,减少[ca’‘],则不利于壳聚糖提高GDH和GS的活性.说明cTS 在调控氨同化关健酶GDH和GS活性时,可能有Ca’+信号系统的参与。此 外,用EGTA和LaCI,处理或是预处理后再用CTS处理,皆抑制了不结球 白菜的生长,并影响不结球白菜的一些品质指标。造成不结球白菜可溶 性总糖含量、蛋白质含量和产量下降,而粗纤维含量上升。Ca’‘及Ca’‘ 结合CTS处理则提高可溶性糖含量和蛋白质含量,降低粗纤维含量,增 加产量。 由于壳聚糖结构的特殊性,因此,它可被用来作为亲和层析的载体. 利用这一性质,我们采用壳聚糖亲和层析法从不结球白菜叶片的粗质膜 中分离纯化了壳聚糖结合蛋白,并鉴定了其部分生化特性.聚丙烯酞胺 凝胶电泳的结果显示只有一条蛋白条带,表示纯化到了单一的壳聚糖结 合蛋白。连续梯度聚丙烯耽胺凝胶电泳、SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳和等 电聚焦的结果表明该蛋白分子量为1“.skDa,由二个相同的亚基组成, 亚基分子量为”.IkDa,等电点为8.25.糖蛋白染色结合考马斯亮蓝染 色的结果证实此结合蛋白是个糖蛋白,其中糖含量为17.44%,蛋白含量 为82.56%.凝集反应确定该糖蛋白也是一个凝集素.由肤质谱测定分析 和结合蛋白数据库检索可知,该结合蛋白与一些酶蛋白如:L一天冬氨酸 氧化酶、天冬氛耽/谷氛酞一tRNA转酞胺酶、谷氛酞一tRNA还原酶和组氛 酞一tRNA合成酶(连接酶)的同源性达到70一80%. 为了探讨壳聚糖调控不结球白菜叶片氛同化关健酶GDH和GS的基因 中文摘要 水平.我们应用定量RT一PCR技术检测了壳聚糖对不结球白菜叶片 GDHmRNA和GSmRNA水平的影响,结果表明壳聚糖处理后,GDHmRNA含量 上升,且GDHmRNA含量的变化与GDH活性的变化趋势基本一致;而GSmRNA 的量基本恒定,并未与GS的活性变化相一致。以上结果初步表明,壳聚 糖可能在转录水平上对氨同化关键酶GDH进行调控;而对GS的调拉则不 在转录水平上,可能发生在其翻译后水平上.


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