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《南京农业大学》 2004年
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有机磷农药长期污染土壤的微生物分子生态效应

张瑞福  
【摘要】: 有机磷农药是曾经得到广泛应用并且应用仍然十分普遍的农药品种,它们的环境效应越来越受到关注。它们的毒性和环境中的化学行为已经得到广泛的研究。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,是土壤肥力的重要指标。农业上使用的农药大部分要最终进入到土壤中。关于有机磷农药长期污染对土壤微生物的影响还未见有报道,而且,一般研究杀虫剂对土壤微生物的影响,都是采用传统的分离培养或测定代谢活力的方法。目前已知,自然环境中的微生物有90%-99%是还未能培养,为了克服上述缺点,分子生物学技术尤其是16S rDNA分析的方法引入土壤微生物群落的分析。 本文研究了长期的有机磷农药污染对土壤微生物的分子生态效应。同时采用分离培养与不依赖于培养的16S rDNA分析的方法研究了有机磷农药长期污染对主要土壤微生物生理功能群数量和微生物群落结构的影响。 有机磷农药释放到环境中,必定会对环境中的微生物群落产生影响,持续的污染使得有的微生物种群数量减少以至被淘汰,有的则适应污染环境而成为优势群。环境微生物群落在长期适应污染的过程中必定会产生种类繁多的有机磷农药降解菌。研究有机磷农药污染环境中有机磷农药降解菌的多样性,对于了解有机磷农药的环境毒理、生物可降解性以及污染环境的修复潜力具有重要参考价值。 有机磷农药污染土壤中降解菌的多样性以及降解基因的保守性,证明了降解基因在污染土壤细菌间发生了水平转移,揭示了土壤微生物群落适应有机磷农药污的分子机制。研究有机磷农药水解酶基因水平转移的分子基础,寻找调控其水平转移的基因序列,可以增强有机磷农药污染土壤的生物修复效果。 一、甲基对硫磷长期污染对土壤微生物的生态学效应 研究了有机磷农药甲基对硫磷长期污染对土壤微生物的影响,实验表明:土壤细菌、放线菌、真菌总的数量影响不大;自生固氮菌和反硝化细菌数量减少;氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌的数量在污染土壤中却有所增加;与对照土壤相比,污染土壤呼吸作用下降了29.93%;氨化作用和硝化作用强度得到增强。 二、土壤微生物总DNA的提取和纯化方法研究 为了采用不依赖于培养的16S rDNA分析的方法研究有机磷农药长期污染对土壤微生物群落结构的影响,建立了从土壤中提取总DNA的方法,并通过改进使适合于对革兰氏阳性菌的提取。用9种性质不同的土壤进行验证,均提取到了DNA,每克干土 有机磷农药长期污染土壤的微生物分子生态效应 的。NA提取量从3.30抖g一13.41”g,通过透析袋回收进行纯化,纯化回收率达到 “.34%,纯化后的土壤DNA可以直接扩增出16SrDNA。9种土壤的提取率从 60.51%一93.45%,可以从每g千土添加362个菌体的土壤中扩增到目的条带. 三、甲基对硫磷长期污染对土壤微生物种群结构的影响 采用不依赖于培养的1 65 rDNA分析的方法研究了甲基对硫磷长期污染对土壤微 生物多样性和种群结构组成的影响。首先提取了对照和甲基对硫磷长期污染两种土 壤样品的总DNA,对照土壤中的总ONA提取量为13.01ug/9.千土,污染土壤中总DN人 提取量为12.23ug/9.干土.应用细菌特异性的165 rDNA引物通过PCR扩增了两种土 壤样品混合的165 rDNA,建立了两种土壤样品165 rDNA文库,应用Rsal和肋;1. 两种四碱基限制性核酸内切酶对两个文库中的1 65 rONA片段进行了限制性片长度多 态性分析。共获得了603种1 65 rDNA的酶切类型,应用各种多样性和均度参数对两 种土壤文库Hhal一Rsal酶切类型的丰富度和分布进行了比较。对两种土壤文库中165 rDNA主要Hhal一Rsal酶切类型的系统发育分析表明微生物种群发生了显著的变化. 在对照土壤中,主要细菌类群是一个新的、尚未培养的细菌类群的成员以及芽袍杆菌、 。一变形杆菌中的成员;而在污染土壤中,细菌主要类群被 flexibactera一eytophaga一baeteroides和v一变形杆菌类群所取代. 四、有机磷农药污染土壤中有机磷农药降解菌的分离与多样性研究 采用添加有机磷农药的选择性培养基,在有机磷农药长期污染的土壤中分离到七 林有机磷农药降解菌,经生理生化鉴定和系统发育分析,菌株mP一1鉴定为 Psouda二j刀obacr。二sp,菌株mp一2为才jeallg。刀。5 sp.,菌株mp一7为Brucolla sp., 其他菌株为ochrobac仃姗sP.。1 6 5 r DNA序列同源性比较、系统发育分析和染色体 ERIC一PcR指纹图谱扩增表明有机磷农药长期污染的土壤中有机磷农药降解菌具有丰 富的多样性。 五、七株有机磷农药降解菌的降解特性比较及其菌株mP一4对三哇磷降解的初步研究 对七株有机磷农药降解菌的降解特性进行了比较,七株降解菌都能利用甲基对硫 磷为唯一碳源生长,并生成中间代谢产物对稍基酚。对稍基酚的降解经过一段延滞期, 不同菌株降解对稍基酚的能力和延滞期有很大差异.降解菌株对多种有机磷类农药和 芳香族化合物具有降解能力,其降解谱表现了一定的差异。与其他菌株相比,菌株mp一4 能降解有机磷农药三哇磷,三哇磷农药是我国南方稻区广泛应用的品种,对菌株mP一4 降解三吐磷进行了初步研究,试验表明,在实验室与水稻田间试
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