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《南京农业大学》 2004年
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草鱼α_2巨球蛋白的纯化、特性研究、基因扩增及其初步应用

李凤玲  
【摘要】:α_2巨球蛋白(α_2M)是动物体内的一种非特异性免疫因子,在鱼类抵抗外来病原菌的入侵中具有重要作用。在研究草鱼对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila Ah)不易感的物质基础为α_2巨球蛋白的基础上,进一步研究其结构和功能。通过聚乙二醇分级沉淀、凝胶过滤和阴离子交换层析,从草鱼血浆中分离纯化了α_2M。在非变性条件下电泳,草鱼α_2M的电泳图谱表现为一条带;在变性条件下电泳,草鱼α_2M的电泳图谱表现为两条条带,表明草鱼α_2M由两种不同亚基组成,相对分子质量分别为95kD和80kD左右。 草鱼α_2M与人α_2M的理化性质基本相似,在蛋白酶的作用下,有活性的天然S型构象变成无活性的F型。蛋白酶抑制试验表明草鱼α_2M有较强的抑制细菌胞外蛋白酶的活性。免疫双向扩散试验结果表明,草鱼α_2M与人α_2M的抗原性不交叉。 从鲤鱼和草鱼肝脏中提取总RNA,通过对鲤鱼α_2M保守区和诱导区基因序列的分析,设计两对引物,分别用RT-PCR方法扩增并克隆了鲤鱼、草鱼的保守区α_2M基因序列和含有草鱼α_2M诱导区的一段基因。测定了草鱼α_2巨球蛋白诱导区基因序列并推测其氨基酸序列的一级结构,发现草鱼与鲤鱼的α_2巨球蛋白在诱导区差异很大。提示不同动物α_2M抑制胞外蛋白酶的差异性可能与诱导区的差异密切相关。 将致病性嗜水气单胞菌J-1株接种LB培养基,摇床培养180rpm,28℃,24h,90℃30min灭活制得全菌苗。另将上述培养物离心,取上清,经硫酸铵沉淀,透析,90℃30min灭活,制得毒素苗。分别在全菌苗和毒素苗中加入适量草鱼α_2M。用小型饲料机制备5种饲料,分别含有全菌苗、毒素苗、有草鱼α_2M的全菌苗、有草鱼α_2M的毒素苗及普通饲料。实验用剑尾鱼分成5组,每组30尾。用上述5种饲料口服免疫剑尾鱼,连续投喂15d后,再投喂普通饲料20d;对照组用普通饲料连续投喂-35天。而后用AhJ-1株50LD_(50)腹腔注射攻击,全菌苗组30尾剑尾鱼的相对保护率为43.3%,全菌苗+α_2M组的相对保护率为53.3%,毒素苗组的相对保护率为26.7%,毒素苗+α_2M组的相对保护率为30%,对照组全部死亡。试验结果表明,α_2M能够增强免疫效果,对剑尾鱼具有一定的保护力。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S94

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【参考文献】
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