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苹果潜隐性病毒的检测与脱除技术研究

王壮伟  
【摘要】: 本研究用热处理+茎尖培养、热处理+茎尖培养+板蓝根、超低温+茎尖培养三种方法对苹果病毒进行了脱除,通过分析各方法的主要影响因子,确立了苹果脱毒的优化体系;建立了一种简便有效的苹果总RNA提取新方法;用RT-PCR对苹果潜隐性病毒进行了检测,并对RT-PCR体系进行了优化。结果如下: 1.用斑点酶联免疫吸附法检测了苹果褪绿叶斑病毒,该法操作简单,可有效地减轻单宁等物质对苹果褪绿叶斑病毒的钝化作用,提高检测的灵敏度。 2.研究了苹果总RNA提取方法,设计了一种新的RNA提取方法,用酸酚及140mM的NaCl来去除DNA,水不溶性PVP、β-巯基乙醇去除酚类物质,15%无水乙醇、1/5体积的3M KAC(pH4.8)来去除多糖,得到高质量的总RNA,该法操作简单,只需要3-4个小时。 3.用RT-PCR法对苹果潜隐性病毒ACLSV、ASGV、ASPV进行了检测。约0.02μg的苹果总RNA依然能扩增出特异性带。 4.用热处理+茎尖培养脱除病毒,转接后试管苗的培养时间以7—15天为宜;采用32℃8h和37℃8h交替处理60天的变温热处理法,试管苗热处理的成活率提高了11%,脱毒率提高了7.5%;茎尖分化培养基是影响茎尖分化的重要因素,不同的品种最佳培养基激素浓度配比不同,茎尖分化培养基BA与NAA配比应适当高于该品种继代培养基BA、NAA的配比,长富二号、金矮生适宜的分化培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L,王林、美富、新乔纳金适宜的分化培养基为MS+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L。 5.在热处理+茎尖培养法的基础上,茎尖分化培养基中添加2.0g/L的板蓝根,可达到100%的脱毒率。但药害现象严重,茎尖的分化率只有16%,生长量大大降低。 6.用超低温+茎尖培养法脱除了苹果病毒,脱毒率可达70%。研究了3种玻璃化保护剂对成活率的影响,玻璃化保护剂PVS2、PVS3的效果最好,相差不大,其组成为PVS2:35%甘油+15%EG+35%蔗糖MS培养基;PVS3:40%甘油+10%EG+45%蔗糖+10%DMSO;PVS一步装载处理90min茎尖再生率最高,为45.5%;采用逐步装载,即先用装载液(15%甘油+15%蔗糖)处理20min,60%PVS3处理20min,PVS3处理80min,效果好于一步装载,茎尖再生率可达57.3%。


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