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河南省肉牛规模化养殖场牛病毒性腹泻的诊断与防制技术研究

张光辉  
【摘要】:牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的,主要侵害牛、羊、鹿、牦牛、猪等动物的一种重要的传染病,临床主要表现为发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或畸形胎儿。世界每年死于BVDV感染的牛不少于500万头,占牛饲养总数的0.5%~1%。随着我国养牛业的迅速发展,国外品种不断引进,该病在我国发生、流行呈上升趋势。早在20世纪60年代,我国的云南、山东、四川等地就有类似该病发生。目前,该病在河南也普遍存在。为找到一种快速诊断BVD的方法,有效地控制其蔓延,做好防制工作,减少BVD对河南省肉牛业造成的损失,本论文从以下几个方面进行了研究: 1、河南省牛病毒性腹泻流行病学调查 从河南省唐河、内乡等15个县市的不同牛群随即采集血样671份,从养牛业比较发达的南阳、周口、安阳3市部分规模化肉牛场随机采集645份血样,分别用牛病毒性腹泻抗体和抗原ELISA试剂盒检测,结果表明:671份血样中,154份为抗体阳性,阳性率为22.95%;645份血样中100份为BVDV阳性,其检出率为15.50%,从而证实BVD在河南省广泛存在。 2、河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定 从河南省不同地区规模化肉牛场BVD疑似病例中采集病料,将处理好的病料接种MDBK细胞,并盲传四代,分离得到两株可产生细胞病变的病毒,经电镜观察、理化特性鉴定、琼脂扩散试验和中和试验,确定两株病毒均为BVDV,分别将其命名为HN-1株和HN-2株。动物回归试验进一步证实了所分离的两株病毒均为BVDV。 3、分泌抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定 在MDBK细胞上增殖BVDV HN-1株,用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒,然后免疫BALB/c小鼠。应用单克隆抗体技术,制备脾细胞并与NS_0骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA筛选,用有限稀释法亚克隆,得到4株能分泌BVDV单克隆抗体的杂交瘤细胞林:3A_8、3C_7、3C_(11)、3E_9。经鉴定,3A_8、3C_7、3E_9株分泌的单克隆抗林为IgG1亚类,3C_(11),株为IgG2a亚类。杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条。3A_8、3C_7、3C_(11)株分泌的抗体与CSFV,BDV发生交叉反应,与BCV、BRV无交叉反应,而3C_(11)株 河南省肉牛规模化养殖场病毒性腹泻病的诊断与防制技术研究 分泌的抗体与以上四种病毒均不发生交叉反应,显示出较好的特异性。这些单克隆杭 体的获得为BVD的研究及诊断方法的建立莫定了基础. 4、牛病毒性腹泻病毒单克隆杭体双夹心ELISA的建立及其应用 用3C:l株,按常规方法制备腹水、提纯IgG,与已制备的兔抗BVDV IgG建立了 检测BvDv的单克隆杭体双夹心ELISA。该方法与病毒分离试验对比,阳性符合率 为86.67%,阴性符合率为100%;与中和试验对比,阳性符合率为93.33%,阴性符合 率为100%。该方法最低病毒检出量为20on留ml。用该方法与商品化EusA试剂盒同 时对比检测牛全血100份,二者阳性检出符合率为96.巧%。初步应用该方法对河南 省南阳、周口、安阳3市肉牛场的562头份牛全血的检测结果表明,牛群BVDV的感 染率为1 7.08%。该方法具有良好的特异性、敏感性及稳定性,能够较好地用于BVDV 的监测,具有良好的应用前景。 5、牛病毒性腹泻囊素油乳剂灭活疫苗的研制 将BVDV HN一1株在MDBK细胞上增殖、浓缩、灭活,并与免疫增强剂一一囊素 共同乳化研制出BVD囊素油乳剂苗。对其物理性状、安全性、保存期等进行检测, 初步应用该疫苗进行免疫试验,并和常规灭活苗以及弱毒苗进行免疫效果比较。试验 结果表明:该疫苗合格、安全,保存期达到12个月;产生的抗体水平较高且维持时 间长,免疫效果和保护率优于常规灭活苗和弱毒苗. 6、肉牛规模化养殖场病毒性腹泻防制措施的制定及实施效果分析 根据BvD流行病学特征,结合本研究成果,从品种选育、饲养管理、饲料营养、 环境调控、免疫预防、兽医卫生等方面制定了一套BvD防制措施。并在河南的南阳、 周口、安阳3市部分肉牛场进行了实施,实施效果表明:试验牛场BVD感染率、发 病率、牛场整体病死率均有所下降,在一定程度上控制了该病的流行和传播,提高了 肉牛的生产性能,取得了显著的经济效益和社会效益。 关健词:牛病毒性腹泻;牛病毒性腹泻病毒;流行病学;分离鉴定;单克隆杭体; 双杭夹心ELISA;囊素油乳剂苗;防制措施


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