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《南京农业大学》 2004年
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棉铃虫对转Bt基因棉抗性的分子机理及抗性基因分子检测技术

苏建亚  
【摘要】:通过克隆棉铃虫敏感品系(YCS)和抗性品系(YCR)幼虫中肠Bt毒素受体基因,我们克隆到了棉铃虫幼虫中肠氨肽酶N基因家族4个成员的cDNA:APN1(AY358034)、APN2(AY346383)、APN3(AY279537)和APN4(AY279534)。其cDNA序列分别具有3220、3209、3053及2862个核苷酸,含有3042、3096、3045及2853bp的开放阅读框,编码产生1014、1032、1014和951个氨基酸的蛋白质。这4个氨肽酶均具有锌离子结合模体(HEXXHX_(18)E)和GAMEN结构域,为典型的锌金属蛋白酶。在N’末端均有疏水性信号肽用于引导该蛋白穿过胞膜到胞外,在APN2、APN3、APN4的C’末端还有糖基磷酯酰肌醇(GPI)锚添加信号序列,它是该蛋白质是否添加GPI锚的标志,但在APN1中未发现这一信号序列。 将棉铃虫的这4个氨肽酶的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫的氨肽酶氨基酸序列比对,根据同源性程度,鳞翅目昆虫的氨肽酶可归为5个组,组内各氨肽酶的同源性为55%~90%,组间的同源性为30%~45%。这4个氨肽酶分属其中4组,其中第2组还仅有棉铃虫的APN2(AY346383)和小菜蛾的APN2(AJ222699),其它组内分别有5~9种昆虫的氨肽酶,预示着在第5组中还会有1个氨肽酶未克隆到。 比较抗性品系(YCR)品系与敏感品系(YCS)间各氨肽酶N成员的序列差异,抗性品系与敏感品系间APN1的氨基酸序列中只有2个氨基酸不同,而且均不在毒素结合部位,初步认为抗性品系APN1的2个氨基酸突变与毒素在结合部位的抗性无关;APN2有15个氨基酸的变化,其中有2个突变(谷氨酰胺~(137)→谷氨酸和缬氨酸~(173)→苏氨酸)位于Cry1A毒素结合区域;APN3有9个氨基酸的替代,其中苏氨酸~(183)→天冬酰胺位于毒素结合区域内;APN4有7个氨基酸的变化,其中有2个突变(组氨酸~(162)→酪氨酸和脯氨酸~(185)→丝氨酸)位于毒素结合区域内。抗性品系APN2、APN3及APN4位于毒素结合部位的这些突变氨基酸是否与抗性有关还不能排除,尚有待进一步试验研究来验证。 棉铃虫钙粘素基因的cDNA全长为5541bp(登录号:AY351904),具有5190bp的开放阅读框,编码1730个氨基酸的多肽。推定的氨基酸序列为典型的跨膜蛋白,由含12个钙粘素胞外重复结构域(EC1~12)、一个由22个氨基酸组成的跨膜区(TM)以及126个氨基酸的胞质区(CP)组成,胞外区的N末端还有22个氨基酸的信号 棉铃虫对转Bt基因棉抗性的分子机理及抗性基因分子检测技术 肤.棉铃虫钙粘素氨基酸序列与蜂翅目其它昆虫的钙粘素具较高同源性50%~80%, 与人的E一型钙粘素同源性仅为22%。编码棉铃虫钙粘素mRNA的基因组DNA序列 (AY714876)至少由33个外显子构成,最长的外显子为308bp,最短的外显子仅 1 sbp.每个结构域的外显子均被1一2个内含子所间隔,最大的单个内含子长度为 1731bP。在棉铃虫中编码Ecs一ECll的DNA序列内含子变异很大,具较高的多态 性。 在棉铃虫抗性品系YCR中,钙粘素基因缺失了4911一14吕70之间的核普酸近10kb (9959bP).从编码EC4的外显子后半部缺失到EClo与ECll相接部分,这区间的 外显子和内含子全部缺失.并造成在成熟mRNA分子中缺失片段后面的序列被剪切 掉,转录形成的mRNA分子仅1581bP,远小于敏感品系棉铃虫中肠的m只NA分子 (554lbP),其翻译产物仅剩428个氨基酸,也远小于正常钙粘素蛋白的1730个氛 基酸,缺失了C末端的胞质区、跨膜区、胞外重复结构域的ECS一EC12及部分EC4. 该突变钙粘素分子在被其N末端信号肤引导穿过细胞膜后,不能固定在细胞膜上, 而成为胞外游离蛋白,无法促进cry1A。毒素与细胞膜间的相互作用,由此推断杭 性品系中钙粘素基因的大片段缺失突变是引起杭性的一个重要分子机理.室内用杭 性和敏感亲本及正交杂合子检测的结果验证了上述推测. 根据棉铃虫抗性品系钙粘素基因缺失突变的特点,选择确定了用等位基因特异 性PCR技术(PASA)检测棉铃虫杭性基因的引物,敏感正向引物为Cad一sF3,杭 性正向引物为Cad一RFI,反向引物为Cad一Rev2.该引物组合扩增的产物条带敏感品 系为900b卜1 .1 kb,杭性品系为338bP,杂合子具有Ikb和338bP的两条带.PcR扩 增的条件是:95℃预变性3min:94℃变性305,62℃退火305,72℃延伸lmin,35 个循环.用上述引物组合,检测了从河北威县采集到的棉铃虫,在采集到的136个 单雌系中,19个单雌系经F;法检测为杭性个体,用PASA法检测到其中有一个个 体为携带有钙粘素突变杭性等位基因的杂合子. 关键词:棉铃虫;杭药性;受体蛋白;钙粘素;氨肤酶
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