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新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗的研究与应用

卫广森  
【摘要】:新生仔猪大肠杆菌性腹泻(Colibacillus diarrhea of newborn piglet)是由产肠毒素性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic E. coli, ETEC)引起的以1~7日龄新生仔猪下痢为特征的一种急性致死性多发性传染病。本病在世界范围内广泛流行,是影响仔猪成活率的主要因素之一。随着疫苗的研发与应用,我国新生仔猪大肠杆菌性腹泻得到了一定程度的控制,但疫苗在免疫原性、安全性等方面仍不理想。因此,研制高效、安全的新型多价基因工程疫苗迫在眉睫。 本研究利用分子生物学技术将ST_1基因与K_(88)ac和LT_B基因融合在一起,研制大肠杆菌三价基因工程灭活疫苗,以期达到增加疫苗的安全性,提高疫苗免疫效果的目的,解决新生仔猪大肠杆菌性腹泻免疫预防这一难题。 (1) 根据已发表的K_(88)ac、ST_1和LT_B基因序列,分别设计并合成一对K_(88)ac引物、三对ST_1引物和一对LT_B引物,利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K_(88)ac基因、ST_1突变基因和LT_B基因。将质粒DNA和扩增的DNA片段进行分离、纯化、限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接,获得重组质粒pXK88acS73LT5并转化BL21(DE3)宿主菌,构建了含K_(88)ac-ST_1-LT_B融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXK88acST3LT5中含有K_(88)ac-ST_1-LT_B融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。将重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)按1%的量接种到含有Kan(50μg·mL~(-1))的LB液体培养基中,37℃振荡培养2h,然后用1mmol·L~(-1)IPTG诱导4h,融合蛋白K_(88)ac-ST_1-LT_B获得高效表达。经ELISA检测,重组菌株表达的K_(88)ac-ST_1-LT_B融合蛋白能够被ST_1单抗、LT_B和K_(88)ac抗体识别。将重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)培养物上清及菌体裂解物,分别进行了乳鼠灌胃试验,结果均为阴性(C/C≤0.083),这表明该融合蛋白K_(88)ac-ST_1-LT_B已丧失天然ST_1肠毒素的活性。用该工程菌株制备的包涵体粗提物和工程菌灭活疫苗免疫小鼠,再用C83902大肠杆菌强毒菌株攻毒均获得了较好的保护,试 新生仔猪大肠杆菌性腹泻际ac一STI一LTI,二价基因「程灭活疫苗的研究与应用 里理里旦巴月里巴里里里里里里里里 验结果表明,肠ac一sT一LT。融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST: 肠毒素毒性的作用,证实了构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基 因工程疫苗的候选菌株。 (2)对构建的表达K::aC一ST!一LT。融合蛋白的重组菌株BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS) 进行了染色特性、培养特性、生化特性、质粒稳定性、免疫原性、保存条件等实验室 试验。结果1一10代菌种染色特性、培养特性、生化特性均符合大肠杆菌特性的要求; 在无选择压力(Kan一)T BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS)菌株连续培养20代,统计质粒 丢失率,其重组质粒保留率为1 00%,表明重组质粒pXK88aeST3LTS在受体菌BL21(DE3) 中能较稳定传代:重组菌株BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS)经诱导后的培养物,用SDS- 聚丙烯酞胺凝胶电泳和薄层凝胶扫描分析,结果表明融合蛋白占菌体总蛋白的相对含 量能稳定在73%以上;分另,J用BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS)菌株第1代和第10代基础 种子的培养物制备的疫苗免疫小鼠后,用1 MLD(5/10吕CFU)强毒菌液攻击,其保护 率为90.6,表明1一10代基础种子均可作为疫苗生产用菌株,其免疫原性稳定。因此, 基础种子代次暂定为1一10代;菌种保存试验确定,甘油保存菌种在一20℃保存期为 2年,冻干保存菌种在一20℃保存期暂定为3年;最小免疫剂量测定结果表明小鼠的 最小免疫剂量每只为0.lmL,妊振母猪的最小免疫剂量每头为2.smL;制备的5批 实验室产品均安全有效;试验中本疫苗保存18个月,仍具有良好的效力,保护率达 8既以上,为了保证疫苗质量,并考虑疫苗在保存和应用中的各种不确定因素,将本 疫苗的保存期暂定为12个月。为了进一步验证疫苗的安全性和有效性,在不同地区 进行T田间试验,免疫妊娠母猪6 50头,产仔7 1 56头,平均保护率为98.2406,试验 证明本疚苗安全性良好,新生仔猪通过吮吸母乳获得被动免疫可有效地预防新生仔猪 大肠性腹泻的发生。 (3)以实验室工艺为基础,进行了工业化生产工艺的研究。用发酵罐培养,改 良LB培养基培养的菌数与普通肉汤培养基的菌数基本一致,明显高于LB培养基的菌 数,根据BL21(DE3)(pXK88aeST3LTS)菌株培养的稳定性和降低生产成本的要求,故改 良LB培养基为该菌株的最佳培养基;经诱导剂筛选试验分析,100 mmol·L一,乳糖组 诱导效果略低于1 mmol·L一,IpTG组,但优于10 mmol·L一,乳糖组,1 mmol·L一,乳糖 组诱导效果最差,在工业化生产上为了降低生产成本,故选择乳糖作为诱导剂; 摘要 aL21(nE3)(pxK88acsT3LTS)菌株添加终浓度为100 mm。l·L一,乳糖进行诱导后,目的 蛋白于Zh呈现表达,随着诱导时间的延长,总菌数和目的蛋白表达总数均相应增加, 5一6h趋于稳定,确定了乳糖诱导的浓度为10Omm。l·L一,,诱导时间不低于6h;通 气培养条件试验表明,BLzl(。Es)(pxKssacST3LTs)菌株以2、10,mL发酵罐通气培养, 在500L·min一?


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