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《南京农业大学》 2004年
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毛木耳(Auricularia Polytricha)漆酶纯化、漆酶特性及漆酶基因克隆的研究

杨建明  
【摘要】:漆酶(ρ-diphcnol oxidasc EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶。漆酶具有很多重要的生物学作用:在高等植物中,与木质部的降解作用相关。在大型真菌中,它与色素的形成、子实体的形成、木质素的降解和分生孢子的致病性和脱毒作用有关。本论文从木耳胞外漆酶高产菌株的筛选、胞外漆酶蛋白纯化及漆酶基因克隆等三个方面进行了初步研究,为今后研究漆酶在木耳的生长过程中所起的生物学功能奠定了必要的理论基础。 通过对木耳属中的三个种的27个菌株的产过氧化物酶、漆酶能力的检测,从中筛选得到一漆酶高产菌株毛木耳(Auricularia polytricha)AP4,并且对AP4的产漆酶的发酵条件进行了初步研究。结果表明:同属于木耳属的三个种之间及种内间的分泌过氧化物酶、产漆酶的能力差异均很大;摇瓶实验产漆酶(1accase)的最佳培养基的成分为:碳源为CMC5g/L,氮源为NH_4NO_3+L-Asparagine24mmol/L,培养基的初始pH4.0,培养温度25℃。 对毛木耳AP4的粗酶液进行PAGE电泳后发现含有三种漆酶同工酶(LacA,LacB,LacC),并且通过运用Natire SDS-PAGE获得三种漆酶的分子量大小约分别为:LacA(110KD);LacB(84KD);LacC(65KD)。对漆酶粗酶液通过硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析进行纯化,用SDS-PAGE证明获得了纯化的单一漆酶LacB,并且对漆酶LacB进行了酶学性质方面的初步研究,结果表明:漆酶LacB的最适反应温度为30℃,最适pH为3.0。此酶氧化ABTS的Km值为6.64×10~(-5)mmol/L;金属离子对LacB酶活的影响很大,其中Ga~(2+),Mg~(2+),Zn~(2+),Na~(2+),Ag~(2+)对漆酶LacB有明显的激活作用;Co~(2+),Hg~(2+),Fe~(3+),Fe~(2+),Ba~(2+)等对酶活有明显的抑制作用;LacB和其它真菌漆酶一样具有底物专一性不强的特点,并且LacB对RB亮兰染料有很好的脱色作用。 根据真菌漆酶基因的保守Cu-bind结构域的氨基酸序列设计简并引物,以毛木耳基因组DNA为模板,经PCR扩增获得了一个204bp的木耳漆酶基因特异性DNA片段。利用获得的木耳漆酶基因特异性片段,设计了一对专一引物,通过RACE方法获得了 毛木耳(Aurz’cu1arjap口1.tr,’eha)漆醉纯化、漆醉特性及漆醉基因克隆的研究 编码毛木耳漆酶基因的。DNA全长序列;该序列全长为1972bP,运用PCgene软件分析 得知它包括一个186Obp的完整阅读框(ORF),从33至1892核昔酸,其编码619个 氨基酸,编码的蛋白分子量大小约为68KD,等电点PI约为5.15. 利用Signa1P vZ.o软件分析编码的氨基酸序列发现其N端包括一典型信号肤序 列(1一18aa),剪切位点为(GLG一AL)。通过应用Sca叩rosite程序可得出在lacl基 因编码的氨基酸序列中含有8个N一糖基化位点(N一X一S/T),天东酞胺残基分别位于氨 基酸序列的第46、59、84、214、231、281、308、373处,它们都是潜在的糖基化位 点。应用RPS--Blast进行保守结构域分析表明,该蛋白有三个保守的结构域(如图4): 即KOG 1 263、Sufl和pfam00394。其中K0G1263和Sufl是多铜氧化酶中与次级代谢物 生物合成、运输和分解代谢相关的结构域:第三个pfalnOO394是Cu--oxidase的保守 结构域。 木耳漆酶的氨基酸序列与GeneBank中登录的真菌漆酶氨基酸序列比对表明:该 氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%, 相似性为58%。 根据获得的漆酶基因cDNA全长序列的起始密码子和终止密码子的位置,设计了 一对特异性引物,以毛木耳基因组为模板,经PcR扩增获得了该漆酶基因的全长基因 组序列,大小为2514bp。通过比较漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发 现该漆酶基因包含了14个外显子和13个内含子。 将获得的漆酶荃因2口‘I的全长eDNA序列,以BalnHI和Notl位点装入毕赤酵 母表达载体pPICgK中,获得重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醉诱 导表达了漆酶活性,从而进一步证明了laol为木耳漆酶基因。 关键词:毛木耳妙4漆酶酶学性质基因克隆
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