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虎粪细菌区系16SrDNA动态

图雅  
【摘要】:试验首先对虎粪微生物区系的核酸提取方法进行了筛选,并针对虎粪微生物区系的特殊性对其16S rDNA的PCR扩增进行了组分的优化。通过建立16S rDNA克隆文库对虎粪微生物区系的多样性进行了研究。在此基础上利用PCR-DGGE技术,对3只东北虎及2只白孟加拉虎的粪微生物区系进行了观察发现,虎的怀孕期微生物呈现相对稳定的带型变化,同时,使用抗生素及应激反应等均可显著地改变虎粪微生物区系的动态变化过程。1 用于虎粪微生物区系分子生态学研究核酸提取方法的筛选 为筛选在虎粪微生物区系分子生态学研究中核酸提取的方法,选3只东北虎及3只白虎,各取5个粪样,对每一粪样的平行样,分别采用超声波等10种方法裂解细菌细胞,酚/氯仿抽提细菌核酸,以细菌16S rDNA的保守序列V6及V8区的两段序列作为上下游引物进行PCR扩增,扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)。结果发现,不同的细菌裂解方法可获得不同的带型,机械法中超声波法和均质法在DGGE上获得的条带较多。在采用超声波裂解细菌的基础上,另取上述动物各5个粪样,对每一粪样的平行样,利用改良CTAB法等5种方法抽提核酸。结果表明,改良CTAB法抽提获得细菌核酸的PCR产物在DGGE凝胶上获得的条带最多,结果稳定。综上可见,采用超声波法裂解细菌,再以改良CTAB法抽提细菌核酸,适用于虎粪微生物区系的研究。 2.虎粪微生物区系PCR扩增反应条件的优化 对粪微生物区系的研究将有助于对肠道微生态学的了解,目前PCR-DGGE方法是研究家畜及人粪微生物区系的有效手段之一。由于虎粪微生物区系的特殊性,有必要对PCR反应中的各组分进行优化。本实验对该体系的条件进行了优化筛选。PCR扩增产物用凝胶成像系统及Quantity One定量检测,并通过多元回归曲线得到各组分信噪比的最大值。结果表明,在模板DNA为1-10ng,MgCL_2(25mM)为12μL,DNTP为8pM,引物为190pM,可获最佳结果。与PCR常规条件相比较,产物量增加。


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