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《南京农业大学》 2005年
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捻转血矛线虫BZ抗性等位基因多重PCR检测及新基因Hc38的克隆、表达与特性分析

薄新文  
【摘要】:捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)属毛圆科(Trichostrongylide)血矛属(Haemonchus)线虫,分布较广,寄生于反刍动物第四胃和小肠,因吸血可导致贫血和衰弱,引起幼龄动物,尤其是羔羊死亡,对畜牧业造成极大经济损失。多年来,苯并咪唑类药物一直是防治本病的主要化学药物之一。但使用次数过频以及剂量不合适使线虫对该类药物的抗性日益成为世界各地牛羊线虫防治的重要问题。如何快速、准确检测虫体药物抗性受到人们的关注,我国在该领域的工作开展甚少。为此,本文主要开展了以下工作: 1.捻转血矛线虫澳大利亚BZ抗性虫株和我国新疆虫株β微管蛋白基因组DNA片段的克隆、分析及虫卵孵化试验 根据GenBank发表的捻转血矛线虫β微管蛋白基因序列设计1对引物,分别以捻转血矛线虫澳大利亚苯并咪唑类药物抗性虫株和我国新疆石河子虫株基因组DNA为模板,采用PCR技术,得到大小约为798bp的产物;将目的片段克隆测序发现:4个序列与GenBank登录序列同源性在90.6-95.1%之间。第200位氨基酸残基密码子在澳大利亚虫株为TAC(酪氨酸),新疆虫株为TTC(苯丙氨酸)。进一步将新疆虫株第200位氨基酸密码子所在的第5外显子PCR扩增克隆测序,与上述测序结果一并分析表明:澳大利亚两个序列与GenBank公布序列尽管核苷酸同源性略有差异(同源性为98.5%),但推测出的氨基酸序列完全一致。新疆虫株3个序列同样如此,只有第200位氨基酸不同;此外,还存在一种TCC(丝氨酸)基因型。对这两个虫株用虫卵孵化试验(Egg hatch assay)进行生物学检测表明,澳大利亚虫株丙硫苯咪唑ED50达0.54ug/ml,为抗药性虫株;新疆石河子株为0.0023 ug/ml,为敏感虫株。 2.多重PCR检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性等位基因方法的建立 利用GenBank发表的捻转血矛线虫β管蛋白基因组DNA序列(X67489)设计2对引物,利用前期构建的两个重组质粒pMD18-T-AuF1和pMD18-T-XJF1为模板,选择合适的引物浓度和比例以及Taq酶,确定所需雌雄虫模板量,从而优化和稳定PCR反应条件,建立检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的多重PCR方法。用澳大利亚抗性虫株做阳性对照,用上海敏感虫株做阴性对照,进行多重PCR反应,琼脂糖核酸电泳图谱表明:澳大利亚虫株表现有F1和F3条带,为抗性图谱,上海敏感虫株只有F2和F3片段,为敏感图谱,建立的多重PCR方法在抗性检测上具有很强的特异性。用
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S852.731

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【引证文献】
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1 李红霞;四种植物病原真菌对多菌灵的抗药性分子遗传机制及其检测技术的研究[D];南京农业大学;2003年
2 闫峰宾;捻转血矛线虫成虫免疫蛋白组和比较蛋白组研究[D];南京农业大学;2009年
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1 荣光;应用RNAi技术研究捻转血矛线虫Hc38基因的生物学功能[D];石河子大学;2007年
2 赵军明;捻转血矛线虫基因Hc38保守结构域所在部分的克隆、表达及免疫保护性试验[D];石河子大学;2008年
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【参考文献】
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【共引文献】
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2 庄金秋;梅建国;沈志强;;犬瘟热病毒实验室检测方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 蒋再学;陈征兵;林文;余邵华;竺薇;张晓明;罗满林;;仔猪伪狂犬PCR鉴定及病毒分离[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
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7 赵东升;盖新娜;孙栋;郭鑫;杨汉春;;猪脑心肌炎灭活疫苗的制备及小鼠免疫研究[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
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1 杨堃;鹅CYP7A1基因克隆、表达调节及表达规律的研究[D];华中农业大学;2010年
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【同被引文献】
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3 张炜;猪链球菌2型免疫蛋白组学和比较蛋白组学研究[D];南京农业大学;2007年
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【二级引证文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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