两个水稻CYP74家族基因的克隆及其中HPL基因的遗传转化
【摘要】：CYP74家族是植物细胞色素P450的一个家族,该家族成员包括AOS(丙二烯氧化物合酶)、HPL(脂氢过氧化物裂解酶)和DES(联乙烯醚合酶)。它们都是植物脂肪酸代谢过程中的酶,它们的催化产物在植物对发育和环境调控应答的许多过程中都具有重要的作用。本研究通过PCR的策略克隆了水稻中的HPL基因和一个新的AOS基因,并通过农杆菌介导的方法进行了水稻HPL基因的遗传转化,此外,还在基因组的水平上研究了CYP74家族在水稻基因组中的分布及特性。所获得的主要结果如下:
1、通过生物信息学的分析结合PCR的策略克隆了水稻HPL基因(OsHPL1),并构建了两个用于转化的双元表达载体:pPZPH2a3(+)-HPL1和pPZPH2a 3(-)-HPL1。这两个双元载体中分别插入了正义和反义的水稻HPL基因全长片段,同时这两个双元载体都是以CaMV 35S启动子驱动,选择标记基因都是潮霉素磷酸酶基因。
2、以农杆菌介导的方法用双元载体pPZPH2a3(+)-HPL1和pPZPH2a3(-)-HPL1分别对水稻品种日本晴(Nipponbare)进行了转化,用双元载体pPZPH2a 3(-)-HPL1对水稻品种北陆(FL2)进行了转化。上述三组转化总计获得了77个转基因单株。经潮霉素离体叶片抗性检测,阳性率为83.1%;PCR检测和T1代种子潮霉素抗性检测也都表明外源基因已经整合到水稻基因组中,Southern杂交显示,外源基因多数是以不止一个拷贝的形式整合进再生植株的。
3、通过生物信息学的分析结合PCR的策略发现并克隆了一个新的水稻AOS基因(OsAOS2)。构建了包含该基因全长的大肠杆菌原核表达载体pET30a-AOS2。初步的大肠杆菌原核表达实验表明OsAOS2基因在大肠杆菌体内是以包涵体的形式表达的,且表达量与IPTG诱导剂的浓度有关。
4、用生物信息学的方法对CYP74家族在水稻基因组内的分布进行了研究。BLAST分析表明,在水稻全基因组中总共存在5个CYP74家族成员。这5个成员中,1个是HPL基因(cYP74B亚家族),另外4个都是AOS基因(均为CYP74A亚家族),没有发现水稻基因组中存在CYP74c和CYP74D这两个亚家族的成员。这5个水稻CYP74基因都是单外显子基因,不含内元。序列分析表明这5个基因在两个亚种间序列差异都不
【关键词】：水稻(Oryza sative L.) CYP74 细胞色素P450 丙二烯氧化物合酶 脂氢过氧化物裂解酶 联乙烯醚合酶 遗传转化
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：S511
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2005.087871
【目录】：
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：S511
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2005.087871
【目录】：
- 中文摘要6-8
- 英文摘要8-10
- 第一章 植物特有的CYP74基因家族研究现状综述10-22
- 1 CYP74的亚家族10-12
- 2 CYP74家族氨基酸序列特征及进化树分析12-14
- 2.1 CYP74家族基因的序列特征12-13
- 2.2 CYP74家族基因的进化树分析13-14
- 3 CYP74家族基因的细胞内定位14-15
- 4 CYP74家族与LOX途径15-19
- 4.1 AOS支路16-17
- 4.2 HPL支路17-18
- 4.3 DES支路18-19
- 5 转基因植株中的CYP74家族基因功能分析19-22
- 第二章 水稻HPL基因的克隆及其转基因植株的获得22-52
- 1 材料与方法22-36
- 2 结果与分析36-49
- 3 讨论49-52
- 第三章 一个新的水稻AOS基因的克隆及其原核表达52-63
- 1 材料与方法52-55
- 2 结果与分析55-61
- 3 讨论61-63
- 第四章 水稻CYP74家族的基因组学分析63-75
- 1 材料与方法63-64
- 2 结果与分析64-74
- 3 讨论74-75
- 全文结论75-76
- 参考文献76-81
- 附录81-92
- 附录Ⅰ 质粒载体pMD18-T的序列图谱81-82
- 附录Ⅱ 质粒载体pPZP2Ha3(+)和pPZP2Ha3(-)的序列图谱82-83
- 附录Ⅲ OsHPL1基因的测序峰图83-86
- 附录Ⅳ 质粒载体pET-30a(+)的序列图谱86-87
- 附录Ⅴ OsAOS2基因的测序峰图87-91
- 附录Ⅵ 本文涉及的DNA分子量标准91-92
- 本论文中的英文缩写及译名92-93
- 致谢93-94
- 在读期间发表的论文94
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| 【参考文献】 | ||
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| 【共引文献】 | ||
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| 【二级参考文献】 | ||
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| 【相似文献】 | ||
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