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《南京农业大学》 2005年
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大豆疫霉的分子检测及其钙调素基因的功能分析

张文利  
【摘要】:大豆疫霉引起的根腐病是大豆生产上极具毁灭性的病害。大豆疫霉可随大豆中携带的土壤进行扩散和传播,是我国的Al类检疫对象。建立快速、准确的方法检测土壤中的大豆疫霉对于控制该病害的传播是十分必要的。本研究用卵菌通用引物DC6/ITS4扩增8个大豆疫霉菌株的核糖体转录间隔区(ITS),并克隆测序。得到的序列与50余个疫霉种ITS序列进行比对,根据序列差异设计大豆疫霉的特异引物PS1/PS2。引物特异性验证实验表明该对引物只从大豆疫霉中扩增得到—330bp的特异条带。该对引物对大豆疫霉纯基因组DNA的检测灵敏度可达1fg。结合简单的过筛方法,此PER体系可在一个工作日内完成对土壤中大豆疫霉的检测,灵敏度可达2个卵孢子/20g土壤。同时借鉴快速的NaOH裂解法,该对引物也可用于发病大豆植株的检测。本套PCR检测技术为土壤及发病植株中大豆疫霉的检测提供了快速、灵敏的方法。 本研究采用real-time PCR对土壤中的大豆疫霉进行了实时定量检测。根据大豆疫霉ITS区的特异片段设计引物PS1/PS2,该引物只能从大豆疫霉中扩增得到—330bp的单一条带。特异引物PS1/PS2结合SYBR~(?) Green Ⅰ荧光染料可完成对土壤中大豆疫霉的定量检测。10倍稀释的5个标准样品DNA量与相应的Ct值构建出real-time PCR的标准曲线,直线方程的相关系数R~2为0.993。对卵孢子悬浮液和灭菌土壤及未灭菌土壤的定量结果表明:在掺入相同数量的卵孢子的情况下,从土壤中提取的DNA量远远低于从卵孢子悬浮液中提取的DNA量;同时从未灭菌土壤中得到的DNA量较灭菌土壤中得到的DNA量少。结果提示土壤及土壤中的微生物影响DNA的提取及real-timePCR的扩增与定量。本研究结果证明建立的real-time PCR反应体系可以应用于土壤中大豆疫霉的检测及定量。 另外,本研究利用Ca~(2+)信号途径的抑制剂EGTA和Verapamil处理大豆疫霉的游动孢子,观察到这两种化学药剂对大豆疫霉游动孢子萌发有强烈的抑制作用。在完全被抑制、不能萌发的孢子内出现许多颗粒状内容物,且部分孢子的膜消解,释放出其中的内容物。PCR克隆了大豆疫霉中的钙调素基因,序列分析表明大豆疫霉钙调素基因核苷酸序列长度为763bp左右,含有内含子;cDNA编码区长523bp,推测的氨基酸序列与其它真菌的钙调素基因的同源性最高可达91%。用RT-PCR的方法研究在大豆疫霉与寄主亲和互作过程中钙调素的表达情况,结果表明互作24h之前钙调素下调表达,48h表达量恢复到与对照相同。提示钙调素基因参与大豆疫霉与大豆亲和互作过
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S435.651

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【引证文献】
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【同被引文献】
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