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不同培养条件对嘎拉苹果愈伤组织遗传变异的影响研究

高兵  
【摘要】:本实验对嘎拉(Gala)苹果单芽系组培苗的获得,叶片愈伤组织的诱导、继代以及愈伤组织在分子水平上的遗传变异进行了系统的研究,主要研究结果如下: 1.以室内水培萌发的芽为外植体,最佳消毒方法是0.1%HgCl_2+吐温(2滴)消毒7min;防止褐化以培养基中添加4 g·L~(-1)PVP,芽接种后暗培养10d并结合3d更换一次培养基效果好;最佳诱导、增殖培养基是MS+BA 2.0 mg·L~(-1)NAA 0.1 mg·L~(-1),继代、扩繁培养基是MS+BA 0.5 mg.L~(-1)NAA 0.1 mg·L~(-1);继代周期以28-30d为宜。 2.以嘎拉苹果单芽系组培苗叶片为外植体诱导愈伤组织,最佳培养基为MS+蔗糖30 g·L~(-1)+2,4-D 2.0 mg.L~(-1)+NAA 0.5 mg·L~(-1)+BA 2.0 mg·L~(-1),诱导率可达93.7%。在愈伤组织诱导过程中,2,4-D起着主导作用。愈伤组织的产生首先需要黑暗条件的启动,其增殖与生长分化則需在光下进行;接种后直接进行光照处理,抑制愈伤组织形成。愈伤组织继代周期以15-30d为宜。 3.在SSR扩增过程中,对反应体系中的模板DNA浓度、MgCl_2浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTP浓度及引物浓度5个因子设立正交试验,建立了SSR扩增反应体系:25μL反应体系中,10×Buffer2.5μL,MgCl_2(25mM)4μL;dNTP(2.5mM)4μL;primer(10μM)1μL;DNA35ng;Taq DNA polymerase 1U。 从26对SSR引物中筛选出多态性最佳的CH02D12(F:AAC CAG ATT TGC TTG CCATC,R:GCT GGT GGT AAA CGT GGT G)用于变异的检测。 利用SSR-PCR扩增对不同培养条件下的愈伤组织进行了遗传变异的鉴定。结果表明,在愈伤组织的培养过程中,变异是普遍存在的。不同物质对愈伤组织变异的影响由大到小依次为:蔗糖2,4-DNAA=BA,愈伤组织变异频率最小的水平分别为:蔗糖30 g·L~(-1),2,4-D 0.05 mg·L~(-1),NAA 0.5 mg·L~(-1),BA 2.0 mg·L~(-1),愈伤组织变异频率最大的水平分别为:蔗糖10 g·L~(-1),2,4-D 2.0 mg·L~(-1),NAA 0.1 mg·L~(-1),BA 4.0mg·L~(-1)。随着继代数的增加,愈伤组织在分子水平上的变异有增加的趋势。


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