水稻非生物胁迫相关锌指蛋白基因的克隆与功能分析
【摘要】：高盐、干旱和低温等非生物胁迫是影响植物生长发育和作物高产的重要限制因素。很多研究集中于分离和鉴定在各种非生物胁迫下增强表达的基因，并期望通过了解这些基因运作的分子机制进而利用这些基因进行基因工程改良，帮助植物抵御各类非生物胁迫，而转录因子在植物的胁迫应答中发挥了至关重要的作用，在植物的基因工程改良中也得到了人们的重视。迄今为止，人们已经在多种植物中分离了大量的非生物胁迫相关转录因子基因，其编码产物几乎囊括了转录因子的各种类型。其中AP2／EREBP转录因子中的DREB亚家族在植物胁迫应答反应中占据着核心地位。
锌指蛋白是一类具有指状结构域的转录因子，主要通过与DNA、RNA的结合或与其它蛋白质的相互作用调控目的基因的表达。锌指蛋白广泛的分布于人类和动植物中。根据锌指蛋白的结构特征和功能差异又可将锌指蛋白分为TFⅢA家族、WRKY家族、GATA家族、DOF家族、PHD家族等。随着基因组测序计划的不断完成，也有越来越多的具有锌指结构的锌指蛋白基因被发现。本文主要是针对锌指蛋白在植物非生物胁迫反应的作用为研究方向，分离了3类胁迫相关的锌指蛋白基因，取得了以下一些研究进展。
首次从单子叶植物水稻中分离了TFⅢA型胁迫相关锌指蛋白基因ZFP18、ZFP245。表达分析表明ZFP18受低温、干旱、高盐和ABA的诱导，而ZFP245仅受低温和干旱的诱导。将ZFP18的启动子融合GUS报告基因转化烟草植株，组织化学检测表明正常生长条件下ZFP18的启动子在烟草幼苗的根、茎以及叶片中都无法检测到GUS报告基因的表达，在NaCl和KCl处理条件下转基因烟草叶盘中GUS高度表达，此外在NaCl处理的根的维管束中也检测到了报告基因的表达，但在其它处理条件下(4℃、20％PEG6000)以及二价阳离子胁迫(Mg~(2+)，Zn~(2+)，Cd~(2+))下没有检测到GUS的活性，推测单双子叶中以ZFP18参与的植物对单价阳离子胁迫的响应途径可能类似，但对渗透胁迫的响应可能有所不同。获得了ZFP245过量表达的烟草转基因植株，取转基因植株的叶盘进行耐逆性检测，结果表明转基因植株叶盘提高了对400mM NaCl以及20％PEF6000的耐受性。综合研究结果表明ZFP18和ZFP245在植物的非生物胁迫应答反应中发挥重要的调控作用，说明单子叶植物中也存在TFⅢA型锌指蛋白参与的环境胁迫信号传导途径。
从水稻中分离了受多种胁迫负调节的锌指蛋白基因SRZ1。SRZ1的表达受低温、干旱、高盐以及ABA的负调控。序列分析和同源建模表明SRZ1可能是RNA结合蛋白。组织表达分析表明SRZ1在检测的根、茎、叶片中组成型表达，而SRZ2在叶片中高丰度表达，在根和穗中的表达量较低。表达分析表明，SRZ1、SRZ2受低温、干
【关键词】：水稻 非生物胁迫 锌指蛋白 基因克隆 功能研究 【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：S511
【DOI】：CNKI:CDMD:1.2006.130474
【目录】：
- 原创性声明3
- 学位论文版权使用授权书3-7
- 摘要7-9
- ABSTRACT9-11
- 第一部分 文献综述11-44
- 第一章 参与非生物胁迫应答反应的植物转录因子12-32
- 1 植物转录因子的结构与特性12-14
- 2 参与植物非生物胁迫应答反应的转录因子14-32
- 2.1 AP2／EREBP转录因子16-23
- 2.2 bZIP转录因子23-24
- 2.3 锌指蛋白24-26
- 2.4 MYB／MYC转录因子26-27
- 2.5 HD-Zip转录因子27-28
- 2.6 NAC转录因子28-32
- 第二章 植物TFⅢA型锌指蛋白的结构与功能32-44
- 1 TFⅢA锌指蛋白的结构32-34
- 2 植物TFⅢA锌指蛋白与目标DNA的作用34-37
- 3 植物中的TFⅢA型锌指蛋白37-44
- 3.1 与发育相关的植物锌指蛋白37-40
- 3.2 植物胁迫相关的TFⅢA型锌指蛋白40-44
- 第二部分 研究报告44-119
- 第三章 水稻TFⅢA型锌指蛋白基因的克隆与功能研究45-75
- 1 材料与方法46-51
- 1.1 植物材料46-47
- 1.2 植物材料的处理47
- 1.3 总RNA的提取与cDNA第一链的合成47
- 1.4 总DNA的提取47
- 1.5 水稻TFⅢA型锌指蛋白基因的克隆47-49
- 1.6 半定量RT-PCR分析49
- 1.7 ZFP18启动子克隆及在转基因烟草中的活性分析49-50
- 1.8 ZFP245过量表达转基因烟草的获得50
- 1.9 转基因烟草的耐逆性分析及叶绿素含量的测定50
- 1.10 生物信息学分析50-51
- 2 结果与分析51-69
- 2.1 水稻非生物胁迫相关TFⅢA型锌指蛋白基因的克隆与序列分析51-53
- 2.2 水稻ZFPs的结构分析及与其它植物TFⅢA型锌指蛋白的比较53-58
- 2.3 水稻ZFPs基因的染色体定位58-59
- 2.4 水稻ZFPs基因的mRNA表达研究59-61
- 2.5 水稻ZFPs基因的启动子序列分析61-62
- 2.6 ZFP18基因启动子的克隆及在转基因烟草中的活性分析62-67
- 2.7 ZFP245基因在烟草中的过量表达研究67-69
- 3 讨论69-75
- 第四章 胁迫抑制表达锌指蛋白基因SRZ1的功能研究75-98
- 1 材料与方法76-79
- 1.1 植物材料76
- 1.2 植物材料的处理76
- 1.3 总RNA的提取与cDNA第一链的合成76
- 1.4 总DNA的提取76-77
- 1.5 SRZ1基因的克隆77
- 1.6 半定量RT-PCR77
- 1.7 SRZ1基因在大肠杆菌中的原核表达77
- 1.8 SRZ1的亚细胞定位77-78
- 1.9 SRZ1启动子克隆及在转基因烟草中的活性分析78
- 1.10 SRZ1过量表达转基因烟草的获得78
- 1.11 转基因烟草的耐逆性分析78-79
- 2 结果与分析79-94
- 2.1 SRZ1基因的克隆与序列分析79-81
- 2.2 SRZ1是一个小的基因家族成员81-83
- 2.3 SRZ1基因可能编码一个RNA结合蛋白83-85
- 2.4 SRZ1在非生物胁迫下的表达分析85-86
- 2.5 SRZ1编码产物的亚细胞定位86-88
- 2.6 SRZ1基因启动子的克隆及在转基因烟草中的活性分析88-90
- 2.7 SRZ1在烟草中的过量表达90-94
- 3 讨论94-98
- 第五章 一个新的锌指蛋白基因家族的鉴定与表达分析98-119
- 1 材料与方法99-102
- 1.1 植物材料99-100
- 1.2 植物材料的处理100
- 1.3 总RNA的提取与cDNA第一链的合成100
- 1.4 总DNA的提取100
- 1.5 水稻和拟南芥AACZ锌指蛋白基因的鉴定100
- 1.6 生物信息学分析100
- 1.7 半定量RT-PCR分析100-101
- 1.8 OsAACZ1基因对酵母细胞的转化101
- 1.9 酵母细胞的耐逆性试验101-102
- 2 结果与分析102-113
- 2.1 OsAACZs基因的鉴定与染色体定位102-103
- 2.2 OsAACZs基因编码产物的序列分析103-108
- 2.3 OsAACZs基因的启动子分析108
- 2.4 OsAACZs基因的组织表达分析108-109
- 2.5 OsAACZs基因在低温和高盐胁迫下的表达分析109-112
- 2.6 OsAACZ1在其它非生物胁迫下的表达分析112-113
- 2.7 OsAACZ1在酵母细胞中的表达113
- 3 讨论113-119
- 全文结论119-120
- 参考文献120-139
- 攻读博士期间发表或待发表的研究论文139-141
- 致谢141
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