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《南京农业大学》 2005年
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多枝赖草(Leymus multicaulis)盐胁迫应答相关基因的克隆及表达分析

史仁玖  
【摘要】:多枝赖草(Leymus mul ticaulis<Kar1 Kir1>Tzvel 1,2n=4X=28,XmXmNsNs)属于小麦近缘属赖草属,分布于欧亚地区不同的生态环境下,我国主要分布于新疆地区,生长于平原绿洲和盐渍化荒漠草甸,具有突出的耐瘠薄、耐盐碱性、耐寒性等特性。开展多枝赖草抗逆分子生物学研究,分离耐盐相关基因,对于农作物的耐盐育种具有重要意义。本研究以盐胁迫下的多枝赖草叶片为材料,改良了多枝赖草叶片总RNA提取方法,建立了适合多枝赖草的mRNA差异显示体系,分离与分析耐盐相关基因cDNA序列,克隆谷胱甘肽还原酶基因。结果如下: 采用四种方法提取多枝赖草叶片总RNA(异硫氰酸胍法、SDS法、CTAB法和TRIZOL试剂快速提取法),结果表明:TRIZOL提取法提取的RNA产量较低,电泳呈现出28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA三条清晰的条带,A_(260)/A_(280)为1.845,A_(260)/A_(230)为2.091,表明RNA的纯度很高。而另外三种方法获得的RNA纯度低,有降解现象。用TRIZOL法提取的RNA作为模板,可以扩增出组成型Actin基因片段,表明提取的多枝赖草叶片总RNA能够满足分子生物学研究需要。 通过对退火温度、模板用量、Taq酶和Mg~(2+)浓度的优化,建立了适合多枝赖草基因差异显示的DDRT-PCR体系。选用26个随机引物,分别与3个锚定引物组合成引物对,进行盐胁迫下多枝赖草mRNA差异显示,获得17个长度在300~600bp的差异cDNA条带,进行序列测定及分析。反Northern杂交分析筛选出11个阳性片段。 GenBank/BLAST分析,DNA片段1编码的蛋白与腺苷酸结合蛋白有29%的相似,这与DNA的表达调节有关;cDNA片段2编码的蛋白质与与UMP/CMP kinase 42%相似,UMP/CMP kinase与核苷酸的磷酸化有关,在信号传导方面起作用cDNA片段4编码的蛋白质与S9蛋白有49%的相似性,S9蛋白具有清除活性氧的功能,而活性氧是各种水分胁迫的主要伤害
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