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《南京农业大学》 2005年
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高效聚磷菌的筛选、ppk基因的克隆及其应用研究

蔡天明  
【摘要】: 水体富营养化是全球十大环境问题之一。氮磷尤其是磷的输入是引起水体富营养化的关键因素。城镇生活污水的排放是水体磷污染的主要来源之一。为解决磷污染所带来的危害,在污水进入水体前进行有效处理,降低排放污水的磷浓度十分必要。目前世界各地大规模污水处理厂主要采用强化生物除磷工艺(EBPR),EBPR工艺具有污泥产生量少、不使用化学物质和运行经济等特征。在EBPR系统中聚磷菌在磷的去除中起着至关重要的作用。但迄今为止,人们仅分离到Acinetobacter species、Microlunatus phosphorus Lampropedia spp.、Pseudomonas spp.等属的为数不多的PABs,而且这些菌纯培养时很少能表现出EBPR系统典型聚磷菌的厌氧特征,有关聚磷菌的工程化应用尚无报道;同时,由于微生物学家和工程专家结合不紧密,加之EBPR系统本身的复杂性,对EBPR的微生物学机理和分子机理了解不多,导致EBPR的稳定运行难以控制和整个生物聚磷研究进展不快。为此,加大聚磷菌的筛选力度,对聚磷菌的聚磷特性和聚磷关键基因,对聚磷菌的工程化应用进行研究十分必重要。 本文以高效聚磷菌聚磷机理研究为主线,从高效聚磷菌的筛选着手,系统研究了高效聚磷菌的生物学特性、聚磷特性、与聚磷相关的ppk基因、高效菌株GM6的定殖及其强化废水生物除磷能力探索了GM6的工程化应用前景,构建了国内生物除磷研究的技术平台,取得了目前国内污水强化生物除磷基础研究和应用领域较为丰富的研究成果。 一.聚磷菌的筛选及生物学特性 改进了高效聚磷菌的筛选方法,筛选出了四株聚磷能力远高于国外报道的野生菌株聚磷水平的高效聚磷株:采取大通量高流量的原则,采用平板梯度稀释涂布、poly-P和PHB染色和蓝白斑筛选获得初选聚磷菌25株;经好氧和厌氧培养确定了四株高效聚磷菌GM1、GM6、GM18和GM21,选择GM1和GM6作为研究材料。经生理生化鉴定和16S rDNA序列分析和同源性比较,GM1被初步鉴定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii);GM6被初步鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。 GM1在合成废水中生长时,最适初始pH为7.0,最适生长温度为30℃,当初始pH值大于8.5或小于5.5时或当温度小于5℃或大于33℃时生长较慢;GM6在合成废水中培养时,最适起始pH为6.5,最适生长温度为27℃,当初始pH值大于8.0或小于5.0时,或当温度小于5℃或大于37℃时生长较慢;装液量对GM1和GM6生长影响不大。 二.GM1和GM6的聚磷特性 GM1和GM6纯培养时表现出了典型PABs的特征,为生物除磷研究提供了宝贵的材料:GM1和GM6在合成废水中培养时,除磷最适初始pH值分别为6.5和7.0,当pH值小于5.5或大于7.5时,除磷能力均下降。GM1和GM6的最适除磷温度为20℃和27℃;当温度大于30℃或小于10℃时,GM1除磷效果明显变差;当温度大于33℃或小于5℃时,GM6的除磷效果明显变差。GM1和GM6对合成废水、MOPS培养基、LB培养基及YG培养基的好氧磷去除率分别在60%-89.6%和63%-96.6%之间(对照菌E.coli的去除率在13.6%-30.8%之间)。GM6的聚磷和放磷能力更强。当以乙酸为底物好氧培养时:GM1和GM6体内能聚集类脂粒PHB,菌体PHB浓度上升与乙酸的浓度下降呈负相关;GM1、GM6厌氧培养时,底物乙酸浓度下降与菌体PHB的上升和磷浓度的增加呈负相关;在起始1h内乙酸的吸收及磷的释放速度较快,随着乙酸的吸收和poly-P的分解,上清液中乙酸浓度下降,磷的浓度上升,两者呈负相关。 三.GM6(Pseudomonas putida)多聚磷酸盐激酶基因ppk的克隆及表达 国内首次克隆了聚磷菌的ppk基因,对ppk基因进行了表达,表达菌株的除磷效率较高。本研究根据ppk基因的保守区设计引物,从GM6的总DNA中扩增到ppk基因的528bp的片段,随后采用一种新型的扩增未知序列的PCR技术SEFA-PCR扩增片段的上下游基因序列,将扩增的片段和扩增的上下游序列进行拼接,用Omiga软件进行开放阅读框分析,预测ppk基因全长为2220bp。其上游为HemB基因,长度可能为1119bp。将GM6的ppk基因序列与其它已报道的ppk基因进行同源性比较,GM6与Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas syringae、Klebsiella aerogenes、Neisseria meningitidis、Acinetobacter sp.ADP1和Escherichia coli K12-MG1655在核对苷酸水平的同源性分别为82%、79%、84%、45%、63%、53%和22%;与Pseudomonas putida KT2440、Acinetobacter.sp.ADP1、Escherichia coli K12-MG1655、Neisseria meningitidis MC58和Pseudomonas aeruginosa PAO1在氨基酸水平的同源性分别为89%、58%、33%、50%和80%。 构建的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET29a-ppk经IPTG诱导3h时,获得了ppk基因的表达产物,其分子量约81 kDa。表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET29a-ppk 12h的磷去除率高达80%(而对照菌株磷去除率仅为18%),远高于国外报道的40%的磷去除率。表明ppk基因在E.coli中的过量表达,导致了E.coli菌体中poly-P的大量聚集,从而使得培养基中的磷酸盐大量的去除。 四.高效聚磷菌GM6在活性污泥中的定殖及强化生物除磷应用研究 首次将高效菌株进行了工程应用,获得了快速强化废水生物除磷的能力。利用三亲接合对高效聚磷菌GM6进行标记,获得gfp基因标记菌株GMTR。试验表明,应在厌氧起始时投加菌株,当接种量小于1%时,GMTR投菌后难以获得生长优势;接种量达到2%时,在装置运行12个循环后,按2%-7.5%四种不同的接种比例投菌时污泥中GMTR的比例相差不大。因此,实际投菌时,确定比例为2%。GMTR在R2中的定殖情况是:在R2的污泥中检出了GMTR,而对照R1污泥中在抗性平板上培养时末检出。投加GMTR至R2后,R2运行21d时,GMTR的比例升至9.2%,GMTR的菌数已占据优势。投加GMTR菌株后,磷的去除率逐渐提高,运行21d时磷的去除率升至96%,28d后出水浓度稳定在0.2 mg L~(-1)左右。运行21d时,装置R2的厌氧和好氧污泥具备了EBPR的典型特征,厌氧1h,能快速放磷除有机物,好氧2h能有效除磷。因此,投加GM6能快速启动和恢复强化生物除磷能力。选择除磷能力较差的生活污水处理设施,利用GM6来强化其除磷能力,按2%比例投菌,投菌6d后,出水磷浓度逐渐下降,至25d时,出水磷浓度小于0.5 mg L~(-1),磷的去除率达96.8%。因此,GM6强化生物除磷效果显著。 五.影响EBPR系统生物除磷的主要因素 研究了进水乙酸浓度、厌氧生境、进水pH、好氧溶氧浓度及污泥泥龄对EBPR系统除磷效果的影响。厌氧45min时,释磷量随着进水中乙酸比例增加逐渐增大,仅以葡萄糖为碳源时释磷量仅为2.25 mg L~(-1),乙酸比例为15%时释磷量为16.69 mg L~(-1),乙酸比例大于30%时释磷量基本不变;厌氧120min时,进水乙酸比例对于磷释放量影响不大。过高的厌氧搅拌转速对厌氧释磷有影响,当转速过高时磷释放量下降。对系统释磷而言,最适pH6.5,当进水pH大于7.0或小于6.0时,磷释放量均下降,当pH大于7.5时,磷的释放量大幅下降。对系统磷去除率而言,进水最适pH为6.5,当进水pH超过7.0时,系统对磷的去除效率迅速下降,当pH值为8.0时的磷去除率仅为39.7%,系统失去了强化生物除磷能力。曝气强度对出水中COD_(Cr)浓度的影响较小,但其对出水磷浓度影响较大,当曝气强度使DO达到2.10 mg L~(-1)时,出水磷浓度下降到0.26mg L~(-1)的水平。污泥泥龄对系统的除磷效果影响较大,当污泥泥龄为4d时,出水磷和COD_(Cr)的浓度分别为0.25 mg L~(-1)和25 mg L~(-1),MLVSS值为2.97 mg L~(-1),厌氧磷的释放量为33.8 mg L~(-1),污泥的磷含量为6.36%,EBPR系统处于良好运行状态。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:X172;Q789

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