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《南京农业大学》 2005年
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SARS病人组织中SARS冠状病毒全基因组克隆、序列分析及病毒样颗粒装配

杨仁全  
【摘要】:2003年春季在我国广东、北京等地人群中爆发了以高热、寒战、肌肉痛、干咳、呼吸困难、高度接触性传染为主要特点的传染性疾病,随后该疾病被正式命名为“严重急性呼吸综合症(简称SARS)”。病因学研究表明,SARS的病因是一种新型冠状病毒,世界卫生组织将其命名为SARS相关冠状病毒(SARS-associated coronavirus,SARS-CoV)。作为一种新发现的病毒,目前对其遗传学和复制、装配机制等还所知甚少,因此开展此方面研究具有重要意义。 笔者参与了SARS病原的调查工作。为深入阐明北京地区流行的SARA-CoV的病原学特征,首先从SARS病人病料标本中进行病毒分离试验。将SARS病人临床标本,如咽拭子、痰液和肺组织标本接种Vero细胞,连续传代后,可观察到显著的细胞病理改变(CPE),表明可能标本中可能存在病毒。电镜观察分离物培养上清负染样本,,可见到形态与典型冠状病毒外观相似的病毒样颗粒;用SARS病人康复期血清进行的间接免疫荧光试验,显示分离物接种培养的细胞胞浆内存在特异性荧光,证实培养物中存在与SARS-CoV相关的病毒抗原;提取分离物总RNA进行RT-PCR检测,可用冠状病毒基因组序列特异性引物扩增特异性片段,克隆扩增片段后进行DNA序列分析,结果显示所扩增的片段为冠状病毒保守的复制酶基因区序列。因此综合以上结果,提示分离到的病毒为SASR冠状病毒 为比较来源于SARS病人人体组织和已经分离、培养的SARS-CoV基因组之间的差异,阐明病毒的遗传和变异特点并深入探讨其致病机制,利用RT-PCR从北京地区一例SARS死亡病人(#5)肺组织总RNA中对SARS-CoV组织毒的基因组全长cDNA进行了克隆和序列分析。参考已经发表的SARS-CoV全序列,将待测定的SARS-CoV全长基因组分成26个片段,设计引物进行扩增。扩增并克隆的26个目的片段覆盖SARS-CoV全长基因组。测序结果表明本次实验中SARS-CoV-5#毒株基因组全长29707个核苷酸。同源性比对结果表明,SARS-CoV组织毒5#基因组序列与BJ01-BJ04地方分离株为同一流行株型。本次试验测定的组织毒的基因组序列在基因组水平上与18株全序列已知人源毒株的碱基差异不明显,而与10株动物来源的SARS-CoV分离株全序列在92个核酸位点上存在明显差异,这说明人源SARS-CoV毒株的全序列与动物源SARS-CoV毒株的全序列存在基因组水平的碱基差异,而细胞培养和人体组织来源的SARS毒株不存在基因组水平的碱基差异。对各种来源的SARS病毒的S蛋白质基因分析同样也显示了类似的碱基差异
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R511.9;R373

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【共引文献】
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