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《南京农业大学》 2005年
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马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因PIN Ⅱ-2x的克隆及其转化水稻的研究

卜庆云  
【摘要】:植物来源的蛋白酶抑制剂种类众多,功能广泛。它可作为植物的储藏蛋白;也可与植物体内的蛋白质相互作用来调节蛋白质的代谢;更为重要的是,它可以作为植物抵抗昆虫和病原菌侵害的重要手段。马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ属于丝氨酸蛋白酶抑制剂亚族,具有抗虫谱广、抗病、抗炎、抗癌等功能,而且对人、畜等安全。此外马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ还具有组织特异型表达和诱导型表达等特征,能受多种外界环境诱导表达,是研究伤害信号传导的模式报告基因。所以研究和利用马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因具有重要的理论意义和实际应用价值。本文是从二倍体马铃薯中克隆了新的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因并转化水稻。主要结果如下: 1、根据GenBank发表的四倍体马铃薯栽培种(Solanum.tuberosum)来源的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因序列,用PCR方法从二倍体马铃薯IVP101(Solanum.phurejia)扩增得到马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的cDNA和DNA,命名为PINⅡ-2x。测序表明,PINⅡ-2x基因组DNA长度580bp,含有一个115bp的内含子,cDNA有462bp(除去终止密码子)。推测的PINⅡ-2x蛋白质分子量是16.6KD,等电点6.08。与其他马铃薯蛋白抑制剂Ⅱ同源性比较表明,核苷酸同源性高达88%;推测的氨基酸序列同源性为93%,并具有完整的信号肽区和两个活性中心。RT-PCR和Northern blot表明,PINⅡ-2x基因的mRNA在叶片中具有伤害诱导表达特性。说明本文克隆的二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因PINⅡ-2x属于马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ家族。 2、为提高PINⅡ-2x基因在转基因水稻中的表达水平,本实验特选择单子叶植物中组成型表达的强启动子,水稻肌动蛋白启动子ActⅠ和玉米泛素蛋白启动子UbiⅠ与PINⅡ-2x构建融合载体。依据设计的载体构建策略,分别构建了水稻肌动蛋白启动子ActⅠ和玉米泛素蛋白启动子UbiⅠ驱动的PINⅡ-2x双元载体,pNAR301(ActⅠ5'+PINⅡ-2x+PINⅡ3'),pNAR302(UbiⅠ5'+PINⅡ-2x+NOS3')。同时构建了四倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因(PINⅡ)自身诱导型表达的启动子驱动的PINⅡ的双元载体,pNAR303(PINⅡ5'+PINⅡ+PINⅡ3')。经过酶切验证后,转化入农杆菌菌株EHA105中。 3、利用农杆菌介导的方法,将含有二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因PINⅡ-2x的两个双元载体pNAR301(ActⅠ5'+PINⅡ-2x+PINⅡ3'),pNAR302(UbiⅡ5'+PINⅡ-2x+NOS3'),以及含有四倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因PINⅡ及其
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S532

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【参考文献】
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