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《南京农业大学》 2006年
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免疫调节型禽流感DNA疫苗pcDNA4.0-IL-2-H5HA的研究

南文龙  
【摘要】:禽流感是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病,严重威胁世界各地的养禽业,常常造成巨大的经济损失,尤其是H5亚型高致病性禽流感常常给养禽业造成毁灭性打击,并严重威胁着人类的健康。禽流感病毒变异快、亚型多,免疫机制复杂。因此,从分子水平上认识禽流感病毒,了解禽流感病毒各基因的功能,遗传变异特性与进化规律是必要的,也是禽流感疫苗研究的基础。目前,常规禽流感灭活疫苗存在着某些无法避免的缺陷,如免疫途径单一,免疫剂量大,常常要多次免疫,成本高,且会导致病毒逃避宿主免疫系统的监视。因此,新型禽流感疫苗的研究迫在眉睫,而DNA疫苗成为新型禽流感疫苗研究的热点。本实验扩增了一株H5亚型禽流感病毒的全基因,以其HA基因构建了DNA疫苗pcDNA4-H5HA,以及直接融合表达细胞因子IL-2为免疫佐剂的DNA疫苗pcDNA4-IL-2-H5HA,并对它们的免疫保护效果进行了初步的探讨。 应用流感病毒通用引物和H5N1亚型AIV特异性引物,采用RT-PCR方法成功扩增出A/duck/shangdong/04的全基因序列。通过基因组序列比较及遗传进化分析表明,它的HA、NA、M、NP、PA、PB2基因与A/goose/Guangdong/1/96(GD96)株同源性分别为97.7% 95.4% 97.2% 96.2% 93.3% 94.5%,结合进化树的分析,推断这6个基因可能起源GD96亚系,是其进化与自然重组的产物。而其NS基因与大陆代表株GD96亲缘性较远,PB1则与已知的亚系关系均较远,在相应的进化树上另成分支。结果表明本株病毒基因组是由两个以上不同基因亚系间发生自然重排的产物,同时也为进一步研究AIV DNA疫苗奠定了基础。 以含有HA基因的质粒为模板,根据其测序结果设计合成了带有酶切位点的HA基因引物,通过PCR扩增出目的片段,将这一片段定向克隆到载体pcDNA4.0中,构建了重组质粒pcDNA4-HSHA。再以IL-2的测序结果设计引物,对IL-2进行酶切位点改造,将改造好的IL-2基因片段连接入pcDNA4-H5HA中,构建了表达融合蛋白的重组质粒pcDNA4-IL-2-H5HA。 用于体内试验的DNA疫苗必须首先证明其能在体外真核动物细胞中表达,目前采用较多的办法是在适当的细胞系中进行瞬时表达。本实验将构建好的两种质粒纯化后,以脂质体法转染单层BHK细胞,48小时后通过间接免疫荧光检测转染结
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S852.5

【参考文献】
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【共引文献】
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