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Sphingobium sp. BHC-A中六六六异构体降解基因的克隆与降解途径的研究

武俊  
【摘要】: 六六六(HCH)是一种曾经在世界范围内广为使用的有机氯杀虫剂,主要包含α,β,γ和δ四种异构体。由于其具有高毒性和高稳定性,给环境带来了严重的污染。Sphingobium sp.BHC-A是一株六六六降解菌,可以在有氧条件下完全降解六六六的四种异构体,尤其对于β和δ两种异构体具有高效降解能力。 本文旨在从Sphingobium sp.BHC-A中克隆出相应的降解α、β、γ和δ四种异构体的基因,并阐明其降解方式与降解途径。 利用PCR的方法,以BHC-A菌株的基因组DNA为模板,扩增出了8个与降解α和γ六六六相关的lin基因:linA、linB2、linC2、linD2、linE2、linF2、linX2与linR2,并测定各基因的核苷酸序列。结果表明这些基因与GeneBank上登陆的α和γ六六六降解基因的同源性均在98%以上,证明降解α与γ异构体的基因具有高度的保守性,同时也证明了在BHC-A菌株体内存在着一条由这8个降解基因组成的能够将α与γ异构体降解为β-酮己二酸的降解途径,该途径与报道的α与γ异构体降解途径相一致。 通过Tn5转座子插入突变法将自杀性质粒pKTY320中的Tn5转座子插入到六六六降解菌Sphingobium sp.BHC-A中,经过初筛和复筛获得了一株完全丧失β异构体降解功能突变株BHC-A45。采用高盐沉淀蛋白质法从中抽提到高质量的基因组DNA.采用鸟枪法构建基因组DNA文库,筛选到一个含有转座子序列的阳性克隆pBHC1.对阳性克隆中转座子侧翼进行测序,结果发现Tn5正好插入linB2基因的341位核苷酸处。利用PCR的方法扩增出linB2基因,将其连接到广宿主载体pBBR1MCS-5上得到pBBR1MCS-5A,通过三亲结合的方法将其导入突变子BHC-A45中,进行功能互补实验。结果显示突变子BHC-A45中在转入了重组质粒pBBR1MCS-5A后,β异构体降解功能得到了恢复。将linB2基因连接到表达载体pET29a上,转化E.coli BL21,获得的阳性克隆显示出了降解β异构体的活性.实验结果说明linB2基因就是β异构体的降解基因。经诱导后linB2基因可以在E.coli BL21中实现高效表达。 利用GC/MS与NMR对UnB2转化β异构体的产物进行的分析,证明β异构体首先被转化为β-五氯环己醇(β-PCHL),β-PCHL继续被LinB2转化生成β-2,3,5,6-四氯-1,4-环己二醇(β-TDOL)。β-TDOL不仅是LinB2转化的终产物,也是Sphingobium sp.BHC-A降解β异构体的终产物。 LinB2对于d异构体也具有类似于β异构体的转化活性,实验证明该酶可以将d异构体首先转化为d-五氯环己醇(d-PCHL),再继续转化d-PCHL生成产物d-2,3,5,6-四氯-1,4-环己二醇(d-TDOL),d-TDOL可以继续被Sphingobium sp.BHC-A所降解。对于α和γ异构体,LinB2没有显示出转化活性。 通过PCR的方法从BHC-A基因组中克隆出linA、linC2、linD2和linX2基因,将这些基因分别连接到表达载体pET29a上,在E.coli BL21中进行表达。在表达产物中只有LinA显示出对于d异构体具有转化活性。GC/MS证明LinA可以将d异构体连续脱去2个氯化氢分子,产生中间产物δ-五氯环己烯(d-PCCH)与不稳定终产物d-1,3,4,6-四氯-1,4-环己二烯(d-1,4-TCDN)。d-1,4-TCDN在没有其他酶催化的情况下会自发脱去1个氯化氨分子生成终产物1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB)。LinB2可以以d-PCCH作为底物,经过连续的两步水解脱氯作用,经历一个未知的中间产物,生成d-2,3,5-三氟-5-环己烯-1,4-二醇(d-2,3,5-TCDL)。同时LinB2还可以以d-1,4-TCDN作为底物,经过连续的两步水解脱氯作用,产生中间不稳定产物d-2,4,5-三氯-2,5-环己二烯-1-醇(d-2,4,5-DNOL)生成d-2,5-二氯-2,5-环己二烯-1,4-二醇(d-2,5-DDOL)。d-2,4,5-DNOL在反应中会自发脱去1个氯化氢分子生成终产物2,5-二氯苯酚(2,5-DCP)。LinA与LinB2组成了一个网络状的d异构体降解途径。d-2,5-DDOL为终产物,Sphingobium sp.BHC-A对其没有降解活性。而d-2,3,5-TCDL则可以被Sphingobium sp.BHC-A继续降解。


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