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《南京农业大学》 2006年
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棉纤维发育相关EST-SSR的特征、功能及其定位

韩志国  
【摘要】: 为了增加微卫星标记用于构建饱和的棉花分子遗传图谱,以及将功能基因组学用于棉纤维发育机理的解析和棉花遗传育种,本研究从大量的亚洲棉和陆地棉纤维发育相关EST中开发SSR引物,并且分析了SSR的特征、功能、海陆间的多态性以及在四倍体棉种At和Dt亚组的分布特征。 从来源于亚洲棉开花后7~10天纤维cDNA文库的1187条EST,设计了763对EST-SSR引物,其中包含简单SSR 605条,复合SSR 158条。605条EST中,六核苷酸和三核苷酸比例最高,分别占到36%和31.3%,二核苷酸重复占20.4%,五核苷酸重复占7.9%,四核苷酸重复占4.6%。在包含简单SSR的605条EST的核苷酸重复基元中,二核苷酸重复中比例最高的是AT/TA,占12.6%。763对EST-SSR引物中687(90%)对可以在异源四倍体陆地棉TM-1和海岛棉海7124中得到扩增产物。其中有120对引物可以在这两个材料间产生多态带型,用于遗传作图。120对EST-SSR引物总共得到143个多态位点,通过作图软件,将其中的135个整合到了已有的包含511个SSR位点的遗传图谱中。从这些135个位点的分布情况来看,并不是随机的,因为有84个分布在染色体At亚组,51个在Dt亚组。 利用构建的7235 5~25天的纤维和徐州142开花后0~5天的胚珠以及3~22天后纤维的cDNA文库,随机测序得到13505条EST,去掉冗余之后为5811条。其中966条包含一个以上微卫星(SSR)。根据EST-SSR引物设计的标准,共得到489对EST-SSR引物。在这部分EST中,三核苷酸重复最多,占59.1%;然后是二核苷酸重复,占30%;四核苷酸重复占6.4%;六核苷酸重复占2.7%;最少的是五核苷酸重复,占1.8%。在所有的重复基元中,AT/TA占的比例最高,约为18.4%,其余的依次为CTT/GAA(5.3%),AG/TC(5.1%),AGA/TCT(4.9%),AGT/TCA(4.5%),AAG/TTC(4.5%)等。489对引物在作图亲本TM-1和海7124间存在多态的共114对,产生130个多态位点。其中129个位点整合到现有的遗传图谱上,有66个分布在染色体At亚组,63个在Dt亚组。 在从Genbank dbEST数据库下载来源于陆地棉遗传标准系TM-1的-3~3dpa胚珠的32190条EST中,去冗余之后为12463条,利用SSRIT和Primer3设计得到454对EST-SSR引物。这些EST重复基元中,六核苷酸重复和三核苷酸重复最多,分别占47.3%和38.8%,二、四、五核苷酸重复分别占7.5%、3.2%、3.2%。所有的核苷酸重复基元中,三核苷酸AGA/TCT所占比例最高,约占4.3%;二核苷酸重复中,比例最高的是AG/TC,占2.6%:四核苷酸重复中,AAAC/TTTG比例最多,占约1.5%;五核苷酸和六核苷酸重复中,CCCAA和CCACCT/GGTGGA所占比例最高,分别是0.4%和1.1%。454对引物扩增海陆BC_1作图群体亲本TM-1和海7124,总共84对产生多态条带,可以进行定位研究。84对引物扩增共存在90个多态位点。其中84个位点(包括8个偏分离位点)能够整合到该作图群体的遗传框架图上。84个位点分布在26条染色体上,有40个分布在染色体At亚组,44个分布在染色体Dt亚组。 616对MUSS/MUCS EST-SSR引物扩增共有22对产生多态条带。产生23个多态位点。其中有22个位点(包括3个偏分离位点)可以整合遗传框架图上。四倍体棉花基因组的At和Dt亚组各分布11个多态位点。 从亚洲棉和陆地棉的87154条EST序列中,利用blastclust软件得到非冗余序列39507条,总长度为28005.9kb,其中二~六核苷酸重复大于等于18bp的SSR共有2146个,平均每13.05kb出现一个SSR。所有的重复类型中,六核苷酸重复最多,占36.8%;AT/TA比例最高,占7.4%。 在本研究得到的386个标记位点中,有24对EST-SSR引物扩增得到的重复位点分布在相应的部分同源染色体上。有16对EST-SSR引物产生的重复位点分布在非部分同源染色体或同一染色体。整合后的图谱包含1052个位点,图距总计6321cM,平均两个位点间的距离为6.0cM。其中A3、A11、D1和D11染色体各包括两个连锁群。每条染色体上的标记数目从22-58不等,图距从144.5-383.5 cM。整合到遗传图谱上的43个偏分离EST-SSR标记中,偏向亲本TM-1的有22个,偏向海7124的有21个。 利用Blast2go软件,将已知功能的EST按照细胞组分、分子功能和生物进程分为三大类。在细胞组分一类中,大多数被归为细胞(cell,41%)和细胞器(organelle,36%)两类;分子功能的分类中,催化活性(catalytic activity)和结合(binding)各约占22%和24%;在第三分类生物进程中,大部分归为生理进程(physiological process,38%)或细胞进程(cellular process,36%)。 本研究将部分糖代谢相关基因、转录因子和信号转导类基因定位到染色体,如蔗糖合酶定位到了A6染色体上,E6定位到A5和D5染色体,MYB60定位到A13染色体等。另外,A8染色体上定位了一个耐盐蛋白基因NAU920。 针对棉花遗传图谱的研究已经开发了多种分子标记,但是根据棉花已克隆的基因开发的SNP标记相对较少。利用PCR技术扩增出陆地棉TM-1和海岛棉海7124中基因FbL2A的序列,分析了材料间存在的单核苷酸多态性(SNPs)。根据TM-1和海7124两个材料中FbL2A基因的测序结果,采用NEBcutter软件分析,选择BstUI内切酶酶解扩增产物,利用Mapmaker v3.0作图软件将FbL2A基因定位到D2染色体。 FIF1基因是棉纤维优势表达的一个基因,研究证明它可能在棉纤维的发育过程中起着很重要的调控作用。根据已发表的亚洲棉FIF1基因,设计特异引物,克隆了陆地棉TM-1和海岛棉海7124中FIF1基因。根据两个四倍体棉花FIF1基因的SNP变异,采用SNAP和CAPs方法将该基因定位到A8染色体。研究表明棉花SNP标记的开发是可行的,也是有效的。 EST-SSR和SNP标记的开发将能够更方便的将EST或基因应用到棉花的图谱构建,QTLs定位及克隆,以及棉花二倍体和四倍体的进化与比较基因组研究。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S562

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