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《南京农业大学》 2006年
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陆地棉农杆菌介导遗传转化体系的优化与利用

吴慎杰  
【摘要】: 传统的棉花农杆菌介导转化使用子叶和下胚轴为外植体,以Coker 312作为模式品种。由于其转化和再生经历体细胞胚胎发生,所以该方法被认为是棉花转化的首选方法,并为棉花转基因做出了巨大的贡献。但这一体系受到了基因型的严重限制,即便是转化成功了的品种仍然受转化周期长、成胚率低、易出现畸形胚、体细胞胚植株再生比例低和缺乏茎的伸长等因素的限制。本研究对传统的转化体系进行了优化,以长江流域主栽品种泗棉3号为受体建立了下胚轴为外植体的高效的转化体系,并首次将插皮接用于棉花再生植株的嫁接;为了进一步提高转化的效率,建立和优化了以泗棉3号胚性愈伤为受体的转化体系,利用此体系已将多个基因成功导入泗棉3号;利用组织培养的方法对WO品系和泗棉3号的再生潜力进行研究。研究的结果如下: 1.分析了影响传统转化体系转化效率的因素;通过改变诱导愈伤时的氮素形态、及时挑选胚性愈伤、利用代谢胁迫促进再生出苗等措施对转化体系进行了优化。对各种胁迫的直接和间接效应以及不同氮素形态的供应进行了理论分析,结果显示氮素形态和透气胁迫对体系的优化至关重要。首次将插皮接技术用于棉花再生植株的繁殖,该技术要求简单,操作方便,成活率90%,延长了砧木的使用时间,有效的缩短了再生植株缓苗时间。 2.以长江流域棉区主栽陆地棉品种泗棉3号下胚轴为外植体建立了高效的转化体系,得到了大量的转基因植株,并提供了相关的分子证据和基因表达证据。发现泗棉3号出现分化中心的主要形态不同于Coker 312,其胚性愈伤组织主要来源于两类初生愈伤组织。收获到部分T_0植株的种子,对它们的T1代植株进行了PCR检测和卡那霉素抗性鉴定;在T_0和R_0代获得了丰富的花器官和株型变异体。 3.通过优化胚性愈伤的繁殖、胚性愈伤的共转化、选择培养和分化成苗技术提高了农杆菌转化棉花胚性愈伤体系的转化效率。感染时受体愈伤状态、共培养的效率和选择培养基的选择效率对转化的效率至关重要。鲜黄的细颗粒状胚性愈伤共转化效率高;AS(乙酰丁香酮)50mg.L~(-1)和共培养温度19℃转化效率最高,AS和培养温度存在显著的互作。胚性愈伤接种尽量分散降低了假阳性,提高了选择效率。该转化方法的周期为5~6个月,阳性率为55.7%,平均每个克隆可获得9.7株转基因植株。采用胚性愈伤的转化方法降低了工作量和成本,提高了转化效率,使规模转化棉花成为现实,为棉花的遗传改良和棉花重要基因的功能分析奠定了基础。 4.以组织培养为手段,对棉花再生能力进行选择同时对胚胎发生的时间和频率、出现分化中心时愈伤的状态和愈伤生长量、以及再生植株有无变异和育性进行选择,获得了品系WO的再生纯系;对泗棉3号进行了第一轮的选择,再生频率由4.5%提高到40%左右,并获得了一个由组培引起的可以遗传的突变体。 5.采用优化了的以下胚轴为外植体的转化方法,经分子验证和基因表达检测(PCR、Southern、RT和点涂PPT),成功的将bar基因导入了模式品种Coker 312,获得了高抗PPT的转化植株.现已获得T_1代抗性植株和1个可以遗传的表型突变体,有待于进一步纯合和分析。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S562

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【引证文献】
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