转rolC基因八棱海棠的获得及其表达研究

【摘要】： 八棱海棠(Malus robusta Rehd.)是目前我国使用最广泛的苹果乔化砧木，虽具有适应性强、与苹果品种亲和力好等诸多优点，但难以适应现代化果树矮化密植的要求。 rolC基因来源于发根农杆菌Ri质粒，其表达产物具有水解结合态细胞分裂素，释放出自由态细胞分裂素，从而改变受体植物内源激素平衡的作用。经rolC基因转化的受体植物，普遍植株矮化的形态学变化，因此，我们将其转化进入八棱海棠基因组，以期获得矮化的苹果砧木。 本文通过超声波直接转导法、超声波辅助农杆菌介导法将rolC基因转化进入八棱海棠基因组，并通过PCR、Southern、RT-PCR和Northern等分子检测技术对利用上述两种方法以及本试验室利用农杆菌介导法所获得的转rolC基因八棱海棠株系进行了分子鉴定。对rolC基因利用农杆菌介导法所获得的3个转基因株系中的表达特征及其表达稳定性进行了研究，研究结论如下： 1．应用超声波辅助农杆菌介导法，对八棱海棠进行rolC基因转化。利用gus基因瞬间表达的方法研究了超声波处理时间、处理时机和农杆菌悬浮液中As浓度对rolC基因转化率的影响。研究结果表明：叶盘在OD_(600)为0.6且含有75mg. L~(-1)As的农杆菌悬浮液中浸泡2分钟后，用功率为100w的超声波处理30秒，再浸泡2分30秒，然后放到的再生培养基上共培养3天，能获得最佳的gus基因瞬间表达率。最佳处理条件下转化683个八棱海棠叶片，共得到138个抗性愈伤组织和15株抗性苗，转化率为2.2％。GUS染色检测结果显示有12个八棱海棠株系的基因组中整合了完整的外源rolC基因。 2．应用超声波直接转导法，对八棱海棠进行rolC基因转化。利用gus基因瞬间表达的方法研究了超声波处理时间、处理功率和转化缓冲液中DMSO浓度对rolC基因转化率的影响。研究结果表明：当DMSO浓度为5％时，用80w功率处理20分钟，能够获得最佳的转化效果。在超声波最佳处理条件下转化486个八棱海棠叶片，共得到237个抗性愈伤组织和9株抗性苗，转化率为1.85％。GUS染色检测结果显示，有8个八棱海棠株系的基因组中整合了完整的外源rolC基因。 3．对分别用农杆菌介导法、超声波辅助农杆菌介导法和超声波直接转导法获得的具有卡那霉素抗性并呈GUS阳性的转rolC基因苹果砧木八棱海棠株系进行分子鉴定和转录水平上的表达情况鉴定。其中3个农杆菌介导法获得的转基因株系和12个超声波辅助农杆菌介导法获得株系PCR检测全部为阳性，超声波直接转导法获得的9个株系PCR检测有8个呈阳性。Southern杂交结果显示：3种方法转化获得的PCR检测呈阳性的23个株系均整合了完整的外源rolC基因。其中，2个农杆菌介导法转基因株系获得了至少1个拷贝，另外1个获得了至少2个拷贝；7个超声波辅助农杆菌转基因株系获得了至少1个拷贝，3个获得了至少2个拷贝，1个获得了至少3个拷贝，1个获得了至少4个拷贝；2个超声波直接转导法转基因株系获得至少2个拷贝，3个株系获得了至少3个拷贝，2个株系获得至少4个拷贝，另外1个获得了至少6个拷贝。RT-PCR检测表明：农杆菌介导法3个转基因株系在转录水平上均获得表达；超声波辅助农杆菌转化12个转基因株系中的10个株系获得表达；而超声波直接转导法8个转基因株系中仅有4个获得表达。此外，对农杆菌介导法获得的不同拷贝数转基因株系进行Northern杂交表明：单拷贝株系在转录水平上的表达丰度高于双拷贝株系。 4．在含有不同种类和浓度的植物生长调节剂的培养基上分别研究转基因植株组培苗茎端增殖、叶片再生、生根等生物学特性；转基因组培苗生物学特性研究结果表明：(1)3个株系转rolC基因八棱海棠茎端增殖、叶片再生、生根所需外源激素浓度均显著低于对照植株，其中单拷贝株系显著低于双拷贝株系。(2)3个转基因八棱海棠株系组培苗生根数极显著高于转基因株系，其中单拷贝株系极显著高于双拷贝株系；转基因株系根长极显著短于对照植株，其中单拷贝株系极显著短于双拷贝株系；转基因株系和对照植株根粗之间均无显著差异。 5．以3个不同转rolC基因八棱海棠株系和对照植株温室苗的茎尖、叶片和根为试材，用酶联免疫吸附法，分别测定其内源细胞分裂素CTKs(iPAs和ZRs)、生长素(IAA)、赤霉素(GA_(1+3))、脱落酸(ABA)的含量。结果表明：rolC基因的转入改变八棱海棠植株中各部位内源激素的含量，但并没有改变其分布情况。3个株系转rolC基因八棱海棠植株中内源激素变化趋势较为一致：各部位的内源细胞分裂素、赤霉素和脱落酸的含量均比未转基因对照植株极显著提高；根部生长素含量极显著提高，而它在茎尖和叶片中含量均极显著下降。 6．生根组培苗移栽4个月后，3个转基因八棱海棠株系株高、节间长度、节间数均极显著小于对照植株，并且单拷贝株系以上各项指标极显著小于双拷贝株系。利用石蜡切片法结合光学显微镜，比较它们的茎叶横切面结构。结果表明：3个转rolC基因八棱海棠的叶片长度、宽度和叶面积显著小于未转基因植株；对照植株叶片下表皮气孔密度极显著大于rolC基因单拷贝株系33a和20a，和双拷贝株系20b相比无显著差异；转基因植株和对照植株的气孔长度和宽度均无显著差异；对照植株上／下表皮细胞密度则极显著小于3个转rolC基因株系；转基因八棱海棠叶片的栅栏组织和海绵组织的比例是未转基因植株的1.39-1.48倍；3个转rolC基因八棱海棠株系的材皮比，导管密度、导管面积以及导管占木质部总面积的比例均显著低于对照植株。 7．以3个株系的转rolC基因八棱海棠在无外界抗性压力筛选情况下无性增殖获得的第1，2，3代继代苗以及通过叶片再生获得的第1，2代再生苗为试材，应用PCR、Southern杂交和RT-PCR研究了外源rolC基因在转基因八棱海棠无性繁殖过程中的遗传稳定性和转录水平上表达的稳定性。在此同时，我们对和rolC基因相关的植株生根能力和增殖能力的遗传特性进行了研究。结果表明：转rolC基因八棱海棠在无性繁殖过程中外源rolC基因不仅能够稳定的遗传，而且能够在转录水平上稳定表达．无性增殖苗和叶片再生苗的生根能力和增殖能力均能获得稳定的遗传。 8．分别研究了盐胁迫和低温胁迫条件下转rolC基因八棱海棠叶片中该基因在转录水平上的表达。结果发现：无论是在盐胁迫还是低温胁迫条件下，rolC基因均能在转录水平上稳定表达，而且随着处理时间的增长，其表达丰度也有所增加。

【关键词】：八棱海棠 rolC基因 转基因植株 分子鉴定 转录表达 生物学特性 遗传表达稳定性
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：S661.1
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