苏中地区猪链球菌分子流行病学调查及猪链球菌2型反应调控因子RevS缺失株的构建

【摘要】： 猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是重要的人兽共患病的病原，能引起猪和人类的脑膜炎、败血症以及突发性死亡，对养猪业造成巨大的经济损失。根据荚膜多糖(capsulaur polysaccharide，CPS)抗原性差异，可将SS分为35个血清型(1～34，1／2)，主要致病血清型为SS1、SS2、SS7和SS9，其中SS2流行最广、致病性最强。国内研究报导主要以SS2为主，其他致病血清型分布和致病作用不明。就SS2而言，不同菌株致病性强弱与其是否携带和表达毒力相关因子有关，但其致病机制不明。本研究对苏中地区正常猪群猪链球菌主要致病血清型携带情况进行调查，对分离菌株毒力因子表型、耐药性和致病性等进行系统鉴定；同时，通过同源重组方法构建了四川强毒株05ZYH33的反应调节因子RevS基因缺失突变株，初步阐明了该反应调控因子对国内毒力株致病性的影响。 1苏中地区猪链球菌主要致病血清型分子流行病学调查 2005年、2006年从苏中地区采集正常屠宰猪样本共303份，以猪链球菌种16S rRNA特异性引物及血清型1型、2型、7型、9型英膜多糖型特异性引物，用PCR方法进行猪链球菌及主要致病血清型的检测。2005年200头健康猪样本中，有176份为16S rRNA阳性，SS检出率为88％；在176份16S rRNA阳性样本中，1型、2型、7型、9型检测阳性标本数分别为17、15、20、52，检出率分别为9.6％、8.5％、11.3％、29.5％。2006年103头健康猪样本中，85份样本检测为16S rRNA阳性，SS检出率为82.5％，85份16S rRNA阳性样本中1型、2型、7型、9型检测阳性标本数分别为15、2、22、17，检出率分别为17.6％、2.3％、25.8％、20％。调查表明，该地区正常猪群中猪链球菌携带率处于较高水平，且多种血清型同时存在。 2猪链球菌2型、7型和9型菌株的分离鉴定 通过PCR初筛和平板法分离到猪链球菌2型3株、猪链球菌7型3株和猪链球菌9型13株。生化试验结果显示所有菌株符合猪链球菌的生化特征。所有分离菌株对青霉素G、红霉素、万古霉素素敏感，但对四环素耐药，其中分离株58c呈多重耐药，分别对四环素、链霉素、磺胺类药、红霉素和克林霉素均耐药。主要毒力因子检测结果显示，所有菌株gdh均呈阳性，mrp、epf、sly、fbp呈阴性，orf2在各菌株中的分布有差异，其毒力因子表型与欧洲分离株不同，与国内暴发流行毒株的毒力因子表型差异显著。 3猪链球菌2型反应调控因子RevS缺失株的构建 2002年Greeff降首次报导反应调节因子(response regulator)RevS基因敲除的SS2在猪各组织器官中的定植能力减弱，作用机制不明。为探讨RevS基因对05ZYH33致病性的影响及其可能的机制，本研究构建中间为壮观霉素抗性基因，两侧为RevS编码基因上、下游同源序列的基因敲除载体，通过同源重组和PCR法鉴定，获得RevS编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代的突变株。该基因敲除后细菌的稳定性、生长曲线、菌落形态、溶血性、染色情况、镜下形态及蛋白表达等基本生物学性状无发生明显改变。动物感染实验显示，RevS突变体对小鼠的致病性显著减弱，但对其主要宿主猪的致病性未见显著改变。