转Harpin_（Xooc）蛋白编码基因对油菜农艺性状及抗菌核病的影响
【摘要】：
由革兰氏阴性植物病原细菌产生的Harpins可以激发烟草过敏性细胞坏死(hypersensitive cell death，HCD)，诱导植物抗病、抗虫，促进植物生长。Harpins类激发子都具有相似的生化特征：富含甘氨酸(Gly)，不含半胱氨酸(Cys)，热稳定，对蛋白酶敏感。温室和田间实验表明，Harpins蛋白处理植物可以诱导对真菌、细菌、病毒、线虫等多种病原物的抵抗，提高植物的产量。此外，将harpin转化烟草，水稻，梨树，都能不同程度的提高转基因植株的抗性。因此，本研究旨在将编码harpinx_(ooc)的基因hrf2转化油菜，以期提高油菜的抗病性和产量。
hrf2基因来源于水稻细条斑菌Xanthomonas oryzae pv．oryzicola菌株RS105，该基因含414 bp，其推测的产物Hrf2含138个氨基酸，分子量约为15.3×10~3。hrf2基因编码的harpinx_(ooc)蛋白具有与其他Harpins蛋白类似的特征和功能。hrf2表达的蛋白质产物能够诱导植物抗病性、抗虫性和促进植物生长等有益效应。
本实验通过PCR方法，从水稻细条斑菌Xanthomonas oryzae pv．oryzicola菌株RS105中扩增出hrf2基因，将其克隆入植物表达载体pBI121，构建pBI121：：hrf2重组质粒。然后将hrf2基因及其启动子和终止子用HindⅢ和EcoRⅠ从pBI121：：hrf2上切下后回收，连接到用这两个酶切过的转基因表达载体pCAMBIA1301上，构建成重组转基因载体pCAMBIA1301：：hrf2。重组载体转化至大肠杆菌DH5α中，经酶切，测序验证后，通过冻融法转化根癌土壤杆菌LBA4404。菌落PCR和酶切检测后，挑选阳性克隆供转化油菜使用。
由根癌农杆菌LBA4404介导，将重组表达质粒pCAMBIA1301：：hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节，获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株。经PCR，Southern，RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中，并且能在转录水平正常表达。从转hrf2基因的油菜中提取的可溶性蛋白注射烟草能引起过敏反应。
在相同培养条件下，转基因油菜的株高、叶片大小与受体植株无明显差异，生长发育正常，无肉眼可见的HR。转基因油菜的花期略有推迟，结实率差异较大；所有转基因植株的每荚粒数均少于对照，但部分转基因植株的千粒重与对照相比显著增加。T1代油菜种子在含有hyg 50 mg／L的培养基上出现抗感分化。抗病性鉴定结果表明，转hrf2基因的油菜对油菜菌核病有较好的抗性。
【关键词】：hrf2基因 重组转基因载体 农杆菌 过敏反应 抗病性 【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S565.4
【目录】：
- 摘要6-7
- ABSTRACT7-9
- 上篇 文献综述9-29
- 第一章 植物病原细菌产生的Harpins的特征和功能10-18
- 1.Harpins的遗传学特性10-12
- 2.Harpins激发子在植物上的生物学效应12-15
- 3.Hrf2的分子特征15-17
- 4.结语17-18
- 第二章 转基因油菜研究进展18-29
- 1.油菜转基因的受体系统18-21
- 2.油菜转基因的筛选标记21-22
- 3.油菜转基因方法22-25
- 4.遗传转化在油菜上的应用25-27
- 5.油菜转基因研究中的问题与展望27-29
- 下篇 研究内容29-71
- 第一章 植物表达载体的构建30-44
- 1.材料31-32
- 2.方法32-40
- 3.结果和分析40-42
- 4.讨论42-44
- 第二章 转基因油菜的产生和鉴定44-62
- 1.材料和方法44-55
- 2.结果和分析55-59
- 3.讨论59-62
- 第三章 转基因油菜的生物表型测定62-71
- 1.材料和方法62-64
- 2.结果与分析64-69
- 3.讨论69-71
- 参考文献71-79
- 缩略语79-81
- 附录81-83
- 致谢83-84
- 攻读硕士学位期间发表的论文84
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