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《南京农业大学》 2007年 博士论文
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性和生物转化的研究

何成华  
【摘要】: 真菌毒素是由真菌或霉菌产生的有毒次级代谢产物,广泛污染各种饲料原料和成品饲料。动物食入被真菌毒素污染的饲料会造成动物的真菌毒素中毒。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是禾谷镰刀菌在生长的过程中产生的一种主要代谢产物,是单端孢霉烯族毒素中的一种,广泛污染各种谷物和饲料。 本论文主要研究在常规污染剂量下DON对小鼠的毒性和对其生物转化方发法。 试验Ⅰ脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠的生长性能、血液生化和组织病理学的影响。 昆明小鼠40只,分为4组,每组10只,雌雄各半,分别饲喂1mg kg~1DON+基础日粮(1mgDON组)、3mg kg~-1 DON+基础日粮(3mgDON组)、5mg kg~-1DON+基础日粮饲料(5mgDON组)和基础日粮(对照组)。饲喂20天后分别测定生长性能、血清生化、血常规和免疫器官的重量(胸腺,脾脏)等指标,并且观察肝脏、脾脏、十二指肠、胃、肾脏和胸腺的病理变化。结果表明5mg DON组在增重、饲料转化率、免疫器官的重量(胸腺,脾脏)、红细胞计数、平均红细胞体积和血小板计数等方面与对照组相比差异显著(P<0.05);而1mg DON组和3mg DON组与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。在生化方面,5mg DON组血清中的总蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯等方面与对照组相比较差异显著(P<0.05)。5mg DON组的组织器官的病理变化主要表现为:肝脏的淤血、凋亡细胞增加、细胞间的界限不明显、部分细胞核消失和部分肝细胞肿胀;脾脏被膜增厚、脾小梁增生、部分脾细胞变性坏死、脾脏淤血;胸腺的局部出血;胃绒毛的萎缩和局部出血;十二指肠肠绒毛萎缩或脱落;心肌萎缩、心肌变性、心肌细胞肿胀和肾脏髓质出血、肾小球内有浸出物和部分上皮细胞变性等。 试验Ⅱ脱氧雪腐镰刀烯醇对CHO-K1和HL-7702细胞系的细胞毒性 在培养基中加入不同浓度DON(DON终浓度分别为Ong mL~(-1),100ng mL~(-1),200ng mL~(-1),400ng mL~(-1),800ng mL~(-1)),分别用MTT法测定DON对中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)和人肝细胞(HL-7702)的毒性作用,用放射免疫法测定细胞上清液中的白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。结果表明在低浓度时DON对细胞上清液中(100~200 ng mL~(-1))IL-2、IL-6和TNF-α的浓度没有明显的抑制作用(P>0.05),但是在高浓度(400~800 ng mL~(-1))时,却抑制了它们的表达。通过MTT法测得CHO-K1和HL-7702的半抑制浓度(IC_(50))分别为123.5ng mL~(-1)和336.2 ng mL~(-1)。同时在高浓度(400~800 ng mL~(-1))时能明显抑制CHO-K1和HL-7702的生长(p<0.05)。 试验Ⅲ脱氧雪腐镰刀茵烯醇生物转化茵的分离和鉴定 以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)为唯一碳源,通过富集培养从土壤中分离到一株可以生物转化DON的真菌,编号为NJA-1。用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增了该菌的ITS区间(Internal ttanscribed spacer),包括ITS1和ITS2,扩增片段大小为565bp,通过在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库上比较将该菌鉴定了属,然后用种间引物Bt2a和Bt2b扩增了该菌的β-tubulin基因序列,扩增片段大小为511pb。通过ITS和β-tubulin基因序列分析和形态学观察最终鉴定该菌株为塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)。该茵的β-tubulin基因序列在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB的登录号为DQ902579,其与塔宾曲霉AY820009的相似性为99%。 试验ⅣNJA-1茵的体外生物转化和转化产物的检测 把NJA-1加入含有不同浓度DON的无机盐培养基中,在30℃,120r min~(-1),振荡培养14d后,可以转化94.4%的DON。最高浓度达到40mg L~(-1)。分别用薄层层析(TLC),高效液相色谱(HPLC)和高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)对DON的生物转化产物进行了检测。结果表明在365nm紫外灯下检测可见其具有荧光。HPLC检测其既有紫外吸收(波长:218nm)和荧光吸收(Ex=340,Em=450)。HPLC-MS检测其转化产物的相对分子量为314.4,其分子量比DON大18.1,证明NJA-1可以水解DON。 试验V生物转化茵NJA-1对饲料中DON的转化效果 昆明小鼠40只,分为4组,每组10只,雌雄各半,分别饲喂基础日粮(对照组)5mg kg~1DON+5g kg~1NJA-1菌(菌+DON组)、5mg kg~(-1)DON+基础日粮(5mgDON组)、5g kg~1NJA-1菌+基础日粮饲料(菌组)和。饲喂20天后分别测定生长性能、血清生化、血常规和免疫器官的重量(胸腺,脾脏)等指标,并且观察肝脏、脾脏、十二指肠、胃、肾脏和胸腺的病理变化。试验结果表明在饲料添加5g kg~-1的NJA-1菌能减少DON引起的毒性作用。同时在饲料中添加5g kg~(-1)的NJA-1菌没有对昆明小鼠造成明显的副作用,该试验为NJA-1菌的进一步应用研究奠定了基础。


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