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《南京农业大学》 2007年
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Ochrobactrum intermedium DN2烟碱降解途径及其在烟草中的应用研究

袁勇军  
【摘要】: 本文对一株新的烟碱降解细菌Ochrobactrum intermedium DN2进行了较为系统的研究。主要对菌株DN2生长培养基和培养条件进行了优化,研究了烟碱和葡萄糖共代谢的动力学行为,分离、鉴定了烟碱降解的第一个产物并提出了其降解烟碱的途径,对烟草废弃物、烟草薄片料液和烤烟上部烟叶中烟碱进行了生物降解。主要结果如下: 1.从福建三明地区的土壤中分离得到一株能够高效降解烟碱的菌株,编号为DN2。该菌经常规的形态、生理生化分析以及16S rRNA序列同源性分析,鉴定为Ochrobactrum intermedium,属于α-变形杆细菌纲。菌株DN2能够以烟碱为唯一碳源生长,对于500mg·L~(-1)烟碱的降解速率为15mg·L~(-1)·h~(-1),36 h烟碱降解率为97.65%。该菌在烟草工业和环境保护上可能具有应用前景DN2。 2.研究了O.intermedium DN2降解烟碱的特性。结果表明,该菌降解烟碱的最适条件为初始烟碱浓度为2000 mg·L~(-1),接种量为10%,温度30℃,初始pH值为6.5,0.1%葡萄糖,0.1%酵母膏。在该条件下,使用未经烟碱诱导的菌体降解烟碱,60 h内烟碱降解率为98.3%,其降解曲线符合Monod模型零级动力学模型,动力学方程为C=-38.896t+2131.2(R~2=0.9193)。而使用经烟碱诱导的菌体降解烟碱,24h内烟碱降解率为99.2%,其降解曲线符合Monod模型零级动力学,动力学方程为C=-82.363t+2106.8,烟碱降解速率为82.363mg·L~(-1)·h~(-1),决定系数R~2=0.9662。添加0.1%(质量分数)葡萄糖,可提高菌株DN2的烟碱耐受浓度,达5000 mg·L~(-1)。 3.研究了O.intermedium DN2共代谢烟碱和葡萄糖的动力学。研究结果表明,菌株DN2能同时降解烟碱和葡萄糖;在较低浓度烟碱(50mg·L~(-1))和葡萄糖(30,60,120 mg·L~(-1))时,烟碱和葡萄糖的降解动力学均符合一级动力学模型。而在较高浓度烟碱(500 mg·L~(-1))和葡萄糖(120,1000,2000 mg·L~(-1))时,烟碱降解的动力学符合零级动力学模型。当葡萄糖浓度为120-1000 mg·L~(-1)时,对烟碱降解有促进作用;葡萄糖浓度为2000 mg·L~(-1)时,对烟碱降解有抑制作用。葡萄糖浓度为120 mg·L~(-1)时,在共基质的条件下,葡萄糖的降解遵从一级动力学模型;当葡萄糖浓度从1000 mg·L~(-1)增加到2000 mg·L~(-1)时,降解的动力学变为零级反应模型。 4.在烟碱生物降解的研究和实际应用中,需要在较短的时间内获得大量菌体。为了提高O.intermedium DN2的菌体浓度,缩短其培养时间,采用Plackett-Burman设计对影响菌株DN2生长的内在和外在相关因素进行了评价。结果表明,影响菌株DN2生长的显著因素为:胰蛋白胨、MgSO_4·7H_2O、初始pH值、温度、装液量和培养时间。在此基础上,采用响应曲面法分别对该菌生长培养基的组成和培养条件进行优化,得到最佳培养基组成为(g·L~(-1)):胰蛋白胨11.34、牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO_4·7H_2O3.71、pH值7.23;最佳培养条件为温度32℃、转速120 r·min~(-1)、装液量88 mL/250 mL三角瓶、培养时间34 h。5 L发酵罐验证实验表明,菌株DN2达到最大生长量的时间为36 h,与预测值34 h基本一致,比优化前短约12 h;最大菌体浓度为6.49×10~9cfu·mL~(-1),与预测值6.73×10~9 cfu·mL~(-1)接近,比优化前提高近一个数量级。 5.对O.intermedium DN2降解烟碱的产物进行了检测和分析。利用菌株DN2烟碱降解酶制备了烟碱降解的第一个产物,通过强酸型离子树脂Dowex 50分离了该产物。经GC-MS,纸层析、紫外光谱扫描,显色反应和熔点测定,结果表明,该产物的熔点为120-121℃,分子量为178,R_f为0.12-0.13,最大紫外吸收光谱为232nm和295nm,A232/195=2.167,与三氯化铁反应呈桔红色,与硝酸铈反应呈红色,这与6-羟基烟碱的特性基本一致,将其鉴定为6-羟基烟碱。通过GC-MS检测和相关数据库检索,在菌株DN2降解烟碱的发酵液中检测到6-羟基烟碱,6-羟基-N-甲基麦斯明,6-羟基氧化烟碱,6-羟基假氧化烟碱,2,6-二羟基假氧化烟碱,2,6-二羟基吡啶和2,3,6-三羟基吡啶等七种产物,这些产物与A.oxydans P-34降解烟碱的产物相同。据此,我们提出了菌株DN2降解烟碱的途径。 6.利用O.intermedium DN2对烟草废弃物中烟碱进行降解。采用Box-Behnken法研究和探讨初始pH值、接种量和温度对菌株DN2降解烟碱的影响,获得了二次模型。结果表明,该模型极显著(P0.0001)。在α=0.05水平下,各因素对烟碱降解率的线性效应和曲面效应皆显著;初始pH值与接种量,接种量与温度的交互作用显著,而初始pH值与温度的交互作用不显著。通过对二次方程求解得知,pH值为7.27,接种量为14.93%,培养温度为31.85℃时,烟碱降解率的最大预测值为66.13%,而实测值为64.82%,证明模型合适有效。在上述最适培养条件下,考察了菌株DN2对烟草废弃物中烟碱的降解过程。结果表明,16 h烟碱降解率为86.58%,其降解过程符合符合Monod模型的零级反应,动力学方程为:C(t)=-75.67t+1455.4,R~2=0.9096。本试验结果证明O.intermedium DN2具有实际应用价值。 7.为进一步提高O.intermedium DN2对烟草废弃物中烟碱的降解速率,使用响应曲面法考察了酵母膏、葡萄糖和吐温80对烟碱降解的影响。结果表明,影响烟碱降解最重要的因子是酵母膏,其次是葡萄糖,最后是吐温80。对试验数据进行拟合,建立了酵母膏、葡萄糖和吐温80对烟碱降解率的二次多项数学模型。该模型极显著(P0.0001)。通过对模型进行求导和解逆矩阵,可以得到模型的极值点为酵母膏0.94g·L~(-1),葡萄糖1.04 g·L~(-1),吐温80 0.80 g·L~(-1)。使用优化培养基和先前使用的培养基,在30L发酵罐中分别进行了验证试验。结果表明,使用优化培养基,初始烟碱浓度为1200mg·L~(-1)时,10h内降解95.55%,降解速率为116.59 mg·L~(-1)·h~(-1);而在先前的培养基中,烟碱降解率仅仅为2.72%,降解速率为49.36 mg·L~(-1)·h~(-1)。本章获得的培养基经济有效,具有实际使用价值。 8.使用O.intermedium DN2降解烟草薄片料液中的烟碱。研究结果表明,使用氨水调节pH值有利于菌株对烟碱的降解;接种种子液或菌悬液对烟碱降解的影响没有显著差异。烟草薄片料液中烟碱降解的最适条件是:添加0.1%的酵母膏,使用氨水将pH调节到7.0,接种量15%,培养温度30℃。在上述条件下,采用30L发酵罐对料液进行三个批次的半连续发酵,烟碱的平均降解速率为140.55 mg·L~(-1)·h~(-1),远远高于其他烟碱降解菌株。这些研究结果表明,菌株DN2可以降低烟草薄片中的烟碱含量,研究具有重要的应用价值。采用生物技术的方法降解烟草薄片料液中烟碱的研究属首次报道。 9.初步研究了O.intermedium DN2对上部烤烟叶片中烟碱的降解情况。研究结果表明,烟叶经过40min蒸汽熏蒸后有利于烟碱的降解。采用直接喷洒种子液或菌悬液的接种方式对烟碱的降解没有显著差异。考察了菌株DN2对安徽上部烤烟叶片(BF_3)中烟碱降解的影响因素。结果表明,菌株DN2降解烟碱的最适条件为:湿度75%、温度30.37℃、pH7.15、接种量15%,酵母膏0.1%,葡萄糖0.1%。在上述条件下,3d内烟碱浓度从3.92%降解到1.83%,降解率为56.18%。表明,菌株DN2具有解决上部烟叶工业可用性的应用潜力。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:TS41

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