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《南京农业大学》 2007年
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小菜蛾Plutella xylostella (L.)对虫酰肼的抗性及其机理研究

曹广春  
【摘要】: 小菜蛾Plutella xylostella(L.)是十字花科蔬菜的重要害虫,是对农药产生抗药性最严重的害虫之一。其繁殖力强,世代周期短,发育不整齐,世代重迭严重,且可以长距离迁移,这都有利于小菜蛾抗药性的发展。目前在不同地区,已有对菊酯类、氨基甲酸酯类、有机磷类、酰基脲类昆虫生长调节剂、杀蚕毒素类、微生物杀虫剂和已经停用的的滴滴涕等农药产生不同水平抗性的报道。虫酰肼(tebufenozide)是防治小菜蛾的一类新型杀虫剂,由美国罗门哈斯公司开发。它只对鳞翅目昆虫有活性,其作用方式与甾酮类蜕皮激素类似,是与蜕皮激素受体(ECR)结合后通过基因调控来激发蜕皮过程。不同的是,它在昆虫体内不能象蜕皮激素那样很快被降解,从而导致蜕皮过程后期下游基因不能表达,使昆虫因蜕皮过程不能顺利完成而死亡。为了合理应用该类杀虫剂,避免抗药性爆发,本文通过室内抗药性筛选,就小菜蛾对虫酰肼的抗性进行了研究。 1、小菜蛾对虫酰肼抗性的室内筛选与风险评估 以小菜蛾敏感品系为材料,在室内利用虫酰肼隔代处理进行抗性品系的选育,结果发现,在繁殖35代并经虫酰肼筛选17次后,小菜蛾对虫酰肼的抗性增加了93.8倍。在整个抗性筛选过程中,有2个明显的抗性增长阶段,第一个是最初的3次筛选,抗性增加了15.7倍,随后出现一个平坡,在此期间4次筛选仅使抗性由15.7倍增加到17.7倍;第二个抗性增长阶段发生在第8至第14次筛选期间,抗性由17.7倍增加到94.4倍,随后3次筛选,抗性没有明显增长,趋于稳定。该研究结果表明小菜蛾具有对虫酰肼产生高水平抗性的潜力和风险。 2、小菜蛾的虫酰肼抗性品系对其他杀虫剂的交互抗性 测定室内筛选的虫酰肼抗性品系对11种杀虫剂的交互抗性,结果发现,用虫酰肼进行抗性筛选不仅使小菜蛾对虫酰肼产生了高水平抗性(93.8倍),同时对阿维菌素、美满和JS118也产生了显著抗性,其抗性倍数分别为35.7、29.1和16.5倍;而对溴氰菊酯仅表现出低水平的抗性(3.9倍),对氯氰菊酯、氟虫氰、敌百虫、除尽、辛硫磷和乙酰甲胺磷均没有产生明显的抗性,其抗性倍数分别为1.3、1.3、1.1、1.0、0.9和0.8倍。由此认为,虫酰肼与阿维菌素、美满和JS118具有显著的交互抗性,与溴氰菊酯的交互抗性较低,而与氯氰菊酯、氟虫氰、敌百虫、除尽、辛硫磷和乙酰甲胺磷均没有明显的交互抗性,生产上可以利用这些无交互抗性的杀虫剂,进行交替使用或混用来延缓虫酰肼抗性的产生。 3、虫酰肼抗性对小菜蛾生物适合度的影响 通过构建小菜蛾敏感品系(S)和虫酰肼抗性品系(R)的实验种群生命表,比较了抗、感小菜蛾的一系列生长发育和繁殖特征,并用净增殖率(R_0)来确定两个品系的相对适合度。结果表明,R品系与S品系的发育历期、蛹重、成虫羽化率和性比没有显著差异,但R品系幼虫和蛹的存活率、成虫交配率、每雌产卵量和卵孵化率均显著降低。以S品系为标准计算,R品系的相对生物适合度仅有0.35。这意味着虫酰肼抗性可以显著降低小菜蛾的生物适合度,在没有虫酰肼选择压力的情况下,种群中抗性个体的比例将逐步减少,种群对虫酰肼的敏感性将逐步恢复。该研究结果为田间合理用药和抗性治理提供了一定的理论依据。 4、小菜蛾对虫酰肼抗性的遗传方式 以270倍抗性的高抗品系和敏感品系为亲本,采用一系列的杂交实验,研究了小菜蛾对虫酰肼的抗性遗传方式。结果发现,正交F1的LC50为540μg/ml,而反交F1的LC50为2696.4μg/ml,由此看来,小菜蛾对虫酰肼的抗性具有一定的偏母遗传现象。进一步分析发现,敏感品系雌、雄个体在耐药性方面没有出现差异,而抗行品系的雌、雄个体在抗药性上存在明显的差异,由此认定,抗性偏母遗传与胞质遗传无关。通过抗、感品系分雌、雄进行体外抗性相关酶活力测定发现,同一品系雌、雄个体在酶活力上没有明显差异。所以我们认为,该偏母遗传可能是因为性染色体W携带有连锁抗性基因。这是害虫抗药性伴性遗传的第二个实例。 5、小菜蛾对虫酰肼的抗性机理分析 以270倍抗性的高抗品系和敏感品系为材料,分别测定了增效剂在抗、感品系中对虫酰肼的增效作用,并比较了两个品系之间相关酶的活力。结果显示:增效醚(PBO)、磷酸三苯脂(TPP)和顺丁烯二酸二乙酯(DEM)在小菜蛾敏感品系中对虫酰肼的增效活性并不显著,但在抗性品系中却具有很强的增效活性,PBO、TPP和DEM的增效比(SR)分别为5.56、3.42和1.77。与敏感品系相比,抗性品系中多功能氧化酶(MFO)活力增加了2.42倍,酯酶(EST)活力增加了2.10倍,谷胱甘肽S—转移酶(GST)1,2-二氯-4-硝基苯(DCNB)的活力增加了2.00倍,但对1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)的活力仅增加1.13倍。由此认为小菜蛾对虫酰肼的抗性机理涉及到多功能MFO、EST和GST等代谢解毒酶的活力升高,其中MFO活力升高对小菜蛾抗性形成的作用较大,其次是EST和GST。此外,本研究还比较了抗、感品系的几丁质酶和芳基酰氨酶的活力,结果发现,抗性品系的几丁质酶活力显著低于敏感品系,为敏感品系0.26倍,而抗性品系的芳基酰氨酶的活性明显高于敏感品系,是敏感品系的2.55倍。但这种变化与虫酰肼抗性的关系尚需进一步研究。 6、抗药性相关基因的克隆 利用RT-PCR从小菜蛾体内成功地扩增出4个和虫酰肼抗性相关的基因的cDNA片段,分别为蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)513bp、过剩气门蛋白(ultraspiracle,USP)750bp、多巴脱羧酶(dopa-decarboxylase,DDC)489bp、幼虫表皮蛋白(larval cuticle protein,LCP)207bp。进一步利用RACE技术,还成功地扩增出了蜕皮激素受体的全长基因(基因登陆号),为比较抗、感试虫的蜕皮激素受体,寻找抗性相关突变奠定了基础。 7、与小菜蛾虫酰肼抗性相关的靶标突变位点 为了明确小菜蛾对虫酰肼产生抗性的分子生物学机制,本研究对敏感和抗性试虫的蜕皮激素受体基因的全长序列进行了对比。结果发现,在蜕皮激素受体具有配基结合功能的E区域中,几乎所有抗性个体的11螺旋N端都存在一个脯氨酸到丝氨酸(P514S)的突变。通过三维结构模拟发现,该突变位点处于配基结合口袋的开口处,并且对受体空间结构产生了明显的影响。通过检测杂交F2代(RR:RS:SS=3:5:2)及其虫酰肼处理残余群体(RR:RS:SS=8:1:0)的基因型,进一步证实突变导致了小菜蛾的抗药性加强。由此分析认为,这一突变导致了蜕皮激素受体同虫酰肼结合能力的改变,从而导致小菜蛾对虫酰肼产生了抗性。 本研究发现,虽然虫酰肼是一种作用机制特殊的新型杀虫剂,但大田推广应用后,小菜蛾仍具有产生抗性的风险,因此应该注意合理用药和抗性治理。小菜蛾对虫酰肼的早期抗性主要通过解毒代谢能力的增强,因此可以考虑在制剂中加入增效剂,来提高对抗性个体的毒杀效果。而抗性小菜蛾的生物适合度有明显下降,预示可以利用药剂的轮换进行抗性的有效治理,但应避免使用有交互抗性的阿维菌素等药剂。此外,本研究还克隆了抗药性相关的基因,并发现了靶标基因的抗药性相关突变,为进一步深入研究虫酰肼的分子作用机理和抗药性分子机理奠定了坚实基础。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S436.3

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