黄瓜耐热性及热胁迫响应基因研究

【摘要】： 高温是作物生长过程中经常遇到的逆境胁迫，其造成的热害已成为黄瓜(Cucumis sativus L．)夏季栽培与保护地栽培的主要限制因子。如何提高黄瓜耐热性是目前黄瓜育种研究的重要内容之一。正确理解黄瓜的耐热机制则是耐热育种的基础。本文从生理指标和分子生物学等方面对黄瓜耐热性进行了研究，以期更加深刻地理解黄瓜耐热机制，为黄瓜耐热育种打下基础。主要作了以下研究： 1黄瓜热害症状研究及耐热材料筛选 以耐热品种‘Poinsett 97’和热敏品种‘Boothbyls Blonde’为试验材料，采用42℃高温处理黄瓜幼苗24h，观察子叶、幼叶、心叶、下胚轴及整株幼苗的热害症状，并记载热处理后不同时间的热害症状变化。提出了明确的黄瓜幼苗热害症状的分级标准，对于田间热害的诊断及黄瓜耐热性的鉴定与评价具有良好的实用价值。 将不同类型黄瓜品种的种子置于28℃、38℃和42℃温度下进行发芽试验，比较种子的发芽能力。结果表明：不同类型的黄瓜品种在不同的温度下发芽能力存在明显差异，其中西双版纳黄瓜、‘Poinsett 97’、‘北京截头’种子发芽耐热能力明显强于‘HH1-8-57’和‘二早子’。 以所收集的不同生态型的黄瓜品种为试验材料，经田间自然高温幼苗期与成株期耐热性筛选，结合人工高温幼苗耐热性比较。结果获得耐热黄瓜品种材料5个，热敏黄瓜品种材料2个。丰富了黄瓜耐热性与热害研究的材料，有助于解决黄瓜生产中的热害问题。 2黄瓜耐热生理指标研究 以黄瓜耐热品种‘Poinsett 97’、热敏品种‘Boothbyls Blonde’和它们杂交的F_1为实验材料，研究黄瓜幼苗在28℃和38℃下，叶片中保护性酶类活性和膜透性的变化。结果表明：在38℃热胁迫下，耐热品种的相对电导率、MDA含量提高量明显低于热敏品种，而其保护酶SOD、POD活性和PRO含量的提高明显高于热敏品种，CAT活性的降低量明显低于热敏品种。在热胁迫下，F_1的POD活性表现正向杂种优势，其余均为负向优势。 3黄瓜热胁迫响应基因分离和分子标记筛选 为了快速高效地提取黄瓜幼叶总RNA，满足于cDNA-AFLP实验的要求。对Trizol试剂提取总RNA的方法进行了改进，所提RNA经琼脂糖电泳检测，其28S、18S、5S三条带清晰，完整性好，每0.1g幼叶可获得RNA100～150μg，产率高。经反转录、双链cDNA合成和cDNA-AFLP检测，证实提取的RNA完全能达到cDNA-AFLP对RNA的要求。 以耐热品种‘西双版纳黄瓜’和热敏品种‘二早子’为供试材料，对幼苗进行38℃热激处理2h。采用cDNA-AFLP技术比较热激前后基因表达差异，分离黄瓜热激响应基因。利用RT-PCR技术检测所分离基因的表达。从‘二早子’中分离到chrr182(cucumber heat response related)特异片段，经比对发现该片段与转录修复偶联因子(transcription repair coupling factor-TRCF)同源。该基因在38℃下被诱导增强表达。表明黄瓜幼苗耐热性或热伤害的发生可能与TRCF基因的响应有关。 用耐热自交系‘Poinsett 97’和热敏自交系‘Boothbyls Blonde’经杂交和自交构建F_2分离群体，利用分离群体分组分析方法先找到与耐热性状相关的侯选SSR标记，然后在群体中进行验证。筛选到CMCT505的SSR标记与黄瓜耐热性状相关，Mapmaker分析发现该标记的连锁距离为：19.3cM。本研究筛选到与黄瓜耐热相关的SSR分子标记1个，为黄瓜耐热品种选育奠定了基础。 4黄瓜CSHSP70基因克隆、表达及其内含子结构分析 以耐热品种‘西双版纳黄瓜’和热敏品种‘二早子’为供试材料，用25℃、38℃和42℃处理幼苗2h。根据黄瓜CSHSP70基因cDNA序列设计特异引物，采用RT-PCR技术检测黄瓜CSHSP70基因的表达。在25℃下，耐热品种‘西双版纳黄瓜’和热敏品种‘二早子’CSHSP70基因表达量难以检测到；在高温热胁迫下，该基因能明显增强表达，但两类品种CSHSP70基因的表达存在差异，其中热敏品种‘二早子’在38℃下增强表达明显，而耐热品种‘西双版纳黄瓜’则在42℃下才明显增强表达。黄瓜CSHSP70基因在热胁迫下增强表达，这有助于理解黄瓜热害与耐热性的分子机理。 内含子广泛存在于真核生物基因组非编码蛋白的DNA序列中，能够有效地调控基因表达。为了探明黄瓜CSHSP70基因的内含子数目及其结构特点。根据黄瓜CSHSP70基因cDNA序列设计引物，应用PCR技术从gDNA中克隆CSHSP70基因，采用RT-PCR技术验证内含子的存在。经测序与拼接，得到长度为4056bp的黄瓜CSHSP70基因，它包含7个内含子。经分析发现这些内含子富含A·T，具有类似启动子和HSE核心结构的序列存在。对黄瓜、甜瓜和丝瓜CSHSP70基因部分序列的比较分析表明，该基因在这3个葫芦科作物中具有很强的保守性。该基因内含子存在一些特殊结构，可能对其表达具有重要调控作用。

【关键词】：黄瓜 耐热 热害症状 cDNA-AFLP 转录修复偶联因子 保护酶 叶绿体基质HSP70基因
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S642.2
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