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大豆疫霉侵染早期机制的分子解析

陈孝仁  
【摘要】: 大豆疫霉Phytophthora sojae是农业生产上极为重要的植物病原菌之一,由其引起的大豆疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。由于疫霉菌与真菌亲缘关系较远,普通杀菌剂对疫霉菌无效。了解大豆疫霉菌生长发育与致病过程的分子遗传学基础,可以为寻找新的杀菌剂作用靶标,设计新的疫病控制策略提供理论指导。 大豆疫霉原生质体制备及再生菌株生物学性状研究。尝试建立大豆疫霉遗传转化体系,首先对大豆疫霉菌株原生质体的制备条件及再生菌株的生物学性状进行了研究。结果表明:Driselase以及Driselase-Lysing enzyme的混合酶液均能有效地裂解菌株PS2的细胞壁并获得原生质体;其中混合酶液的裂解效果优于Driselase单一酶液,当混合酶液中两个酶的浓度均为15mg·mL~(-1)时,在30℃条件下消化3h后可以产生浓度达4×10~6 mL~(-1)的原生质体。所制备的原生质体经细胞核染料4,6-diamidino-2-phenyl-indole(DAPI)染色后发现,大型均一的原生质体内含有细胞核;原生质体在再生培养基上再生率达1.0%,再生菌株在利马豆培养基上菌落形态呈白色、圆形、毛毡状,其生长速率、致病性均与亲本菌株保持一致。 利用GFP研究大豆疫霉与大豆的互作。利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化原生质体方案,将报告基因绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)转入大豆疫霉,gtp能够在大豆疫霉各生活阶段稳定表达。而且,利用该报告基因系统研究了大豆疫霉在寄主叶片、下胚轴和根部的侵染行为以及显微分析寄主抗性在根部的差异。结果是,gfp基因能够在大豆疫霉菌中稳定表达,菌丝、游动孢子囊、游动孢子、休止孢、卵孢子都观察到荧光;利用GFP可以清楚地观察到大豆疫霉在寄主大豆体内的侵染情况;而且,利用GFP标记,在抗性大豆品种南农8848、威廉姆斯82和感病品种合丰35、威廉姆斯的根部能够观察到大豆疫霉休止孢萌发的芽管长度明显不等长,抗性品种上萌发形成的芽管长于感病品种上形成的芽管。 大豆疫霉早期互作表型研究。为发展控制大豆疫霉根腐病的更好方法,理解大豆疫霉如何逃避或抵抗大豆防卫机制非常重要。大豆疫霉与大豆互作早期,包括前期侵染(pre-infection)阶段,发生许多重要的互作事件。侵入前,大豆疫霉识别寄主信号,形成侵染相关结构,同时也必须对抗寄主先天抗性和入侵引起的诱导抗性。而且,病原物也必须面对侵染早期营养缺乏的情况。大豆疫霉因而须调节自身基因的表达,来应对寄主和环境压力,并且避免被寄主识别。因此,本研究首先分析了大豆疫霉与寄主大豆、非寄主番茄和中国不结球小青菜互作早期双方的表型。结果揭示大豆疫霉在与植物互作早期菌丝尖端均发生变细变长,寄主和非寄主则发生活性氧的迸发。模拟自然条件下大豆疫霉应答氧化压力,结果发现在1mM的过氧化氢终浓度下,游动孢子迅速休止,并且在观察的10h内没有萌发;而在0.3mM的过氧化氢终浓度下,游动孢子的萌发率高于对照,并且芽管的长度长于对照。提示过氧化氢在游动孢子识别寄主、萌发和侵入中可能起着重要作用。游动孢子在大豆叶片、下胚轴和根部均产生明显的附着胞或类似附着胞结构。 大豆与大豆疫霉互作相关的氧化压力反应。重点研究了大豆与大豆疫霉互作早期大豆体内活性氧的代谢活动。利用分光光度法分析了两种不同抗性水平的大豆在与大豆疫霉互作中活性氧的迸发、寄主细胞死亡、脂质过氧化程度、抗氧化酶(过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶)和非酶促抗氧化剂(抗坏血酸和谷胱甘肽)的含量变化。而且,利用染色法对寄主活性氧迸发和细胞死亡进行了研究;分析了互作中大豆叶片致病防卫相关基因的表达变化及外源施用还原剂对互作的影响。结果表明,在接种后,抗病品种(南农493-1)和感病品种(合丰35)均发生了活性氧迸发。受大豆疫霉菌侵染后,大豆各品种都产生了细胞的死亡;丙二醛含量变化趋势与品种抗性呈负相关;在接种后3h内,不同抗性品种体内过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶比活性均上升。大豆疫霉侵染大豆诱导大豆PRS(pathogenesis-related protein genes,PRs)基因的上调表达,在南农493-1中上调表达时间早于合丰35,持续时间也长于后者;外源施用三种还原剂DTT、glutathione、ascorbate均有助于大豆疫霉菌的侵染。结果表明,活性氧代谢可能在大豆与大豆疫霉菌互作中起着重要作用。 大豆疫霉侵染早期诱导表达基因的筛选。为探究大豆疫霉致病性的分子机制,利用抑制性差减杂交方法筛选大豆疫霉侵染大豆早期诱导表达基因,建立了一个大豆疫霉侵染早期诱导表达cDNA文库。该文库包含73个单基因,其中66个在大豆疫霉基因组数据库具有同源序列,7个没有同源序列。这些基因涉及蛋白合成、能量代谢、细胞信号转导、细胞壁建成和转录调节等途径。这些结果为了解大豆疫霉早期侵染大豆过程中差异表达的基因以及卵菌的致病机理提供了依据。 大豆疫霉C_2H_2型锌指蛋白基因的克隆、表达分析及功能验证。从大豆疫霉侵染早期诱导表达文库中克隆出两个基因Pszfl和Psbadhl的全长,并进行了拷贝数分析、聚类分析、转录水平分析,利用转录基因沉默技术研究了这两个基因在大豆疫霉中的功能。分析的结果对于理解大豆疫霉早期侵染机制提供了重要的数据。Pszfl编码一个C_2H_2型锌指蛋白,在大豆疫霉中为单拷贝。在1mM H_2O_2压力下、试验观察的2h内,该基因的表达水平一直升高;在与寄主互作的24h内,转录水平也一直增高。沉默突变体表现出对过氧化氢敏感。结果表明,Pszfl基因可能参与了大豆疫霉早期侵染过程中氧化压力调节。 大豆疫霉等渗调节基因Psbadhl的克隆与功能分析。Psbadhl可能编码一个甜菜碱醛脱氢酶,其氨基酸序列与拟南芥Arabidopsis thialiana的一个甜菜碱醛脱氢酶的序列有55%的同源性,具有甜菜碱醛脱氢酶的保守结构域“xxLELGGKSP”。酶活力测定证实PsBADH1具有甜菜碱醛脱氢酶活性。系统发育分析表明,该基因在系统发育树中与高等真菌相距较远。Southern杂交结果显示,Psbadhl在大豆疫霉基因组中只有1个拷贝。对Psbadhl进行了转录基因沉默分析,结果显示,在所获得的28个转化子中,有2个转化子表现出盐敏感;RT-PCR分析表明,在这2个转化子中检测不到Psbadhl的mRNA的积累,结果揭示Psbadhl与大豆疫霉的等渗调节具有密切关系。


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