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《南京农业大学》 2007年 博士论文
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抗重金属镉、铅单克隆抗体、单链抗体的研制及单链抗体三维结构的模建

朱晓霞  
【摘要】: 重金属是一类很危险的污染物,在生物体内长期积累不可降解,在极其微量的情况下也会产生不良后果。各种生态系统都不同程度受到重金属的影响。重金属通过食物链沉积到人体中,可引起各种疾病甚至癌症,危害还能遗传到下一代。因此重金属在环境、农产品中残留监测都是非常重要的。 本文旨在建立能稳定分泌高亲和力、高特异性抗重金属镉和铅单克隆抗体的杂交瘤细胞株,在对其亲和力、特异性进行鉴定的基础上,建立其免疫分析方法并得到初步应用,克隆抗重金属镉、铅单克隆抗体的重链和轻链可变区基因,构建抗重金属单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行初步鉴定,利用计算机平台和软件进行模拟分析抗镉的单链抗体(ScFv)三维结构。重金属离子通过双功能螯合剂与血蓝蛋白的偶联物作为免疫原,免疫BALB/c鼠。采用杂交瘤技术建立能稳定分泌高亲和力抗重金属镉、铅单克隆抗体的杂交瘤细胞株,大量制备并经盐析、蛋白亲和层析获得纯化的单克隆抗体,间接ELISA法检测效价,非竞争酶免疫实验测定亲和力,竞争ELISA法测定抗体的特异性。采用矩阵实验确定抗原抗体的最佳组合,通过对离子强度、pH值、封闭物等影响因子的研究,确定酶联免疫吸附分析(ELISA)的最佳工作参数,建立定量测定金属离子的间接竞争ELISA方法。在此基础上,选择杂交瘤细胞株,用Trizol试剂提取总RNA,通过RT-PCR,采用小鼠重链可变区和轻链可变区通用引物,扩增抗体可变区基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将两个可变区基因通过连接肽基因连接起来,构建单链抗体基因,克隆到pGEM-T Easy载体中,通过酶切、PCR和测序进行鉴定。然后用限制性内切酶双酶切pGEM-metal-ScFv质粒和pET-30a(+)质粒,构建pET-metal-ScFv重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,筛选阳性菌株,通过酶切、PCR进行鉴定。阳性菌株经IPTG诱导培养后,分离包涵体,进行变性和复性处理,通过SDS-PAGE和竞争抑制ELISA对表达蛋白的分子量和活性进行初步鉴定。在SWISS-MODEL软件服务器上,利用同源蛋白结构预测的方法模建单链抗体分子结构,建立其三维结构模型,运用分子生物学、分子动力学,验证三维结构的合理性。成功建立了七株能稳定分泌抗镉和铅单克隆抗体的杂交瘤细胞株,获得了高纯度的单克隆抗体,蛋白浓度达1.58-5.0mg/mL,Aa6为IgG1亚类,其余的均为IgM亚类,亲和力达10~8-10~(10)L/mol,选亲和力高的抗体建立标准曲线,抗体Aa6和4/7的IC_(50)分别为4.19μg/L和2.72μM,镉和铅的最低检出浓度分别为0.313μg/L和0.056μM,自来水、超纯水等水样中重金属标准液的添加回收率为80-114%。从杂交瘤细胞中成功地扩增出重链和轻链可变区基因,采用重叠延伸PCR获得约750bp大小的单链抗体基因,并克隆到T载体。经测序证实,轻重链可变区基因均在300bp左右,轻重链之间是由45bp连接肽基因连接。然后,成功地将抗金属ScFv基因按设计的VH-linker-VL方向插入表达载体pET-30a(+),转化大肠杆菌,阳性菌落经ITPG诱导后,表达出目的蛋白,目的蛋白主要以包涵体形式存在,经变性和复性处理,可获得分子量大约29KD的蛋白,但亲和力不是很高,抑制率不超过10.6%。获得抗体的分子结构模型,单链抗体的轻、重链联系精密且位置得当,并可分析H链CDR3区主要的抗原结合位点。重金属镉、铅单克隆抗体Aa6和4/7能有效地用于实验室水样的重金属镉和铅残留检测。从杂交瘤细胞株扩增抗体可变区,成功构建了抗金属镉和铅单链抗体基因,在大肠杆菌获得了功能性表达,为进一步开展以抗重金属ScFv为基础的研究奠定了基础,抗体三维模型的建立为进一步分析轻、重链在抗体功能中的作用,为改造抗体、提高抗体活性等方面提供了一种途径。


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