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《南京农业大学》 2007年
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奶牛乳腺上皮细胞高温应答机制的研究

杜娟  
【摘要】: 本研究目的在于揭示奶牛乳腺上皮细胞高温应答机制及调控机理。实验首先构建奶牛乳腺上皮细胞培养体系,对细胞进行温度梯度处理,确定适宜的高温处理温度,在此基础上,进一步研究高温对乳腺细胞生物学活性的影响及作用机理。 1奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定 运用差酶消化法和反复贴壁法建立体外奶牛乳腺上皮细胞培养方法,采用透射电镜、细胞流式术、免疫组化、免疫印迹等方法对乳腺上皮细胞特性进行检测。实验结果表明,运用本方法建立的奶牛乳腺细胞系上皮特性及遗传特征完备。 2高温对乳腺细胞生物学特征的影响 实验通过台盼兰染色、细胞流式术等方法研究高温对乳腺细胞活性、细胞周期及死亡率的影响。结果表明:(1)40℃/41℃高温可使乳腺细胞超微结构发生变化,表现为染色质浓缩、线粒体肿胀、空泡化,形成凋亡小体。(2)40℃/41℃高温可以抑制乳腺细胞的增殖,使细胞产生G_2/M期阻滞,诱导乳腺细胞死亡,并随高温强度的增加而作用增强。(3)40℃/41℃高温可以诱导乳腺细胞产生热耐受性。 3线粒体通路在高温诱导乳腺细胞死亡中的作用 通过对细胞超微结构、细胞增殖、线粒体及相关分子的检测,研究40℃高温对奶牛乳腺上皮细胞的作用机制。结果表明,高温诱导的细胞的死亡呈经典的级联反应,即染色体分布边缘化、线粒体肿胀,线粒体膜电位差(△Ψm)降低,Bax/Bcl-2升高,Capsase-3活性极显著增加,DNA发生损伤。说明高温可通过线粒体途径诱导细胞的死亡。 4高温应激状态下乳腺上皮细胞HSP72的表达及JNK激酶在乳腺细胞高温死亡中的作用 应用RT-PCR、免疫组化、细胞流式术、JNK特异性激活剂/抑制剂等方法,研究与细胞热耐受性密切相关的HSP72表达规律和JNK激酶在乳腺上皮细胞高温应答中的作用。结果表明,(1)40℃高温诱导了奶牛乳腺细胞HSP72的表达,协助细胞获得热耐受性。(2)JNK激酶参与了40℃高温诱导的乳腺细胞死亡调控,抑制JNK激酶活性可以极显著地降低细胞死亡率。 本实验研究了高温对奶牛乳腺上皮细胞的生物学作用,结果表明高温通过线粒体途径诱导细胞死亡,导致DNA的损伤,产生G_2/M期细胞阻滞,抑制细胞增殖,同时又通过诱导HSP72的表达,协助细胞获得热耐受性。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S823

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