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《南京农业大学》 2007年
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离子注入生防菌Bs-916高效突变菌株选育及其拮抗作用分子机理研究

李德全  
【摘要】: 枯草芽孢杆菌生防菌Bs-916能有效控制水稻纹枯病,具有拮抗谱广,生长快,产生抗生素,对水稻有抗性诱导作用的特点,是一种在水稻病害防治中发挥作用的生防因子。离子注入作为一种诱变源,具有突变率高、突变谱广等特点。离子注入作为一种复合诱变,比单一诱变更有效。 为进一步提高、稳定拮抗菌Bs-916的防病能力,本研究利用离子束作为诱变源对生防菌Bs-916进行诱变处理。利用不同剂量的N~+对Bs-916进行处理,确定最佳的离子注入参数。经过三次诱变处理,第1次在30~250×2.6×10~(13)N~+/cm~2之间选取6个剂量注入,分别为30、60、90、120、150和250×2.6×10~(13) N~+/cm~2;第2次在第1次离子注入基础上,在90~800×2.6×10~(13) N~+/cm~2之间选取8个剂量注入,分别为90、120、150、200、250、400、500和800×2.6×10~(13) N~+/cm~2;第3次选取150×2.6×10~(13) N~+/cm~2和250×2.6×10~(13)N~+/cm~2 2个剂量注入。在1300个诱变处理的菌株中,经过初筛、复筛和定量筛选,获得31个拮抗能力比出发菌株Bs-916提高8%以上的菌株,其中11个菌株的拮抗能力提高10%以上。离子注入生防菌Bs-916的最适剂量为150×2.6×10~(13)N~+/cm~2~250×2.6×10~(13) N~+/cm~2,筛选到的这些高效突变菌株均在这个剂量范围内,使用该范围内的剂量进行筛选,可获得较高的正变异率,并且变异的稳定性也较好。 以纹枯病原菌为指示菌筛选到的高效突变菌株,在室内测定对8种不同植物病原菌的拮抗能力,结果表明,高效突变菌株与出发菌株Bs-916比较,对不同病原菌拮抗能力均有不同程度提高,拮抗带宽提高率为4.3%~7.9%。室内对纹枯病原菌抑菌和田间防病测定。盆栽试验结果表明,5个突变菌株对水稻纹枯病防效为84%~87.4%,均好于Bs-916的防效(72.4%),防效提高率为11.6%~15%,其中K33、H74、J71和E73等4个菌株表现较强的抑制纹枯病能力,病斑大小均低于3.0cm。田间小区试验结果表明,4个突变株校正防效为80.55%~82.87%,防病效果比Bs-916高3.2%~19.1%。 生防菌Bs-916及其突变菌株抗菌物质的提取,TLC和HPLC定性、定量分析比较。TLC分析表明,出发菌Bs-916和高效突变菌株分泌的粗脂肽类化合物和纯品表面活性素(surfactin)的Rf值均为0.52;HPLC分析表明,纯品surfactin具有两个异构体的流出峰,出发菌Bs-916和突变菌株分泌的粗脂肽类化合物也有两个流出峰,以纯品的两个峰为对照,Bs-916及其突变菌株和纯品的surfactin具有相同的洗脱时间,HPLC定性分析结果说明:出发菌Bs-916和突变菌株分泌的粗脂肽类化合物为surfactin。以纯品surfactin 1mg/mL含量为标准进行峰面积比较,出发菌Bs-916和突变菌株H74,J71分泌的surfactin分别为1.231mg/mL,3.332mg/mL,2.115mg/mL。HPLC定量分析结果说明:高效突变菌分泌的表面活性素含量比出发菌有较大幅度的提高。Bs-916和突变体Bs-H74分泌surfactin的调控基因克隆、DNA序列分析比较结果表明,surfactin合成的启动子基因序列一些碱基发生了改变,这些改变的碱基可引起surfactin分泌量的变化。 通过分析生防菌Bs-916及其突变菌株的拮抗性能和分泌surfactin能力的关系发现:离子注入后拮抗性能提高的突变菌株,分泌surfactin的能力也提高;拮抗性能降低的突变菌株,分泌的surfactin能力也降低,说明Bs-916的拮抗性能与分泌surfactin能力具有相关性。室内抑菌结果表明,表面活性素能抑制水稻纹枯菌丝生长,引起原生质泄露。 以在植物抗病中起重要作用的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)等为主要指标,对水稻接种纹枯病菌、Bs-916和突变株后,三个酶活性变化比较结果表明,拮抗菌Bs-916及其突变菌株分泌活性物质对水稻具有抗性诱导作用;4个高效突变株比出发菌Bs-916对三个酶活性影响大;同时接种拮抗菌和纹枯病菌比单一接种拮抗菌、纹枯病菌对三个酶活性影响大。
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