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《南京农业大学》 2007年
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羊痒病免疫组织化学检测方法建立及区分牛、羊PrP的单抗2H3的特性研究

张永强  
【摘要】: 羊痒病的检测方法为单克隆抗体介导的免疫学反应,包括ELISA、western blotting和免疫组织化学(IHC)等方法,同时结合脑组织组织病理学观察。本研究通过大肠杆菌融合表达PrP27-30蛋白,制备特异性单克隆抗体,初步寻找单克隆抗体抗原结合位点,对所得单克隆抗体进行免疫学特性分析,选取最佳单克隆抗体,建立我国的羊瘁病免疫组化检测方法,并对我国部分地区采集样品进行普查,在我国羊痒病的监测方面做了比较系统的工作;另外本研究利用突变技术突变单抗2H3结合位点,首次提出并证明羊PrP208位点在不同物种间存在I/M的多态性,这一多态性导致2H3单抗对不同物种PrP亲和力存在差异。 本实验利用PCR方法从小尾寒羊基因组DNA中扩增PrP27-30编码基因,并克隆到硫氧还原蛋白融合表达载体pET32a上,转化至E.coli BL21,IPTG诱导融合表达,得到相对分子质量约为35kD的重组小尾寒羊PrP27-30融合蛋白。以纯化的重组小尾寒羊PrP27-30融合蛋白免疫prp~c基因敲除小鼠,经过两次加强免疫,通过淋巴细胞杂交瘤技术,取脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合,制备出抗小尾寒羊PrP27-30单克隆抗体,经三次亚克隆,筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrP27-30特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 利用大肠杆菌原核表达系统,以相邻肽段间每间隔15个氨基酸(PrP-peptide 2除外),共6段肽段来分段表达小尾寒羊PrP27-30,分别命名为PrP-peptide 1、PrP-peptide 2、PrP-peptide 3、PrP-peptide 4、PrP-peptide 5和PrP-peptide 6。将6段融合蛋白分别与羊痒病单克隆抗体进行Western blotting反应,根据反应情况分析单克隆抗体抗原结合位点的大概位置,初步得到了待检5株羊痒病单克隆抗体的抗原结合位点,其所在位置分别为:2H3在199aa-213aa之间、4C6在153aa-154aa左右、5F11在154aa-168aa之间、7F1在214aa-227aa之间、7F11在154aa-168aa之间。 对2H3、4C6、5F11和7F11四株单克隆抗体与牛、羊PrP~c的ELISA反应特性,与牛和羊prp~c和prp~(Sc)的Western blotting、免疫组化反应特性等几个方面进行了详细的鉴定和分析。结果显示,2H3对羊PrP~c和PrP~(sc)显示了较强的反应性,对牛Prp~c和PrP~(sc)无反应;4C6对牛和羊PrP~(sc)和PrP~(sc)都有较强反应性;5F11和7F11显示出相似的反应特性,对羊PrP~c和PrP~(sc)反应性较强,而对牛PrP~c和PrP~(sc)次之,抗原结合位点结果与单抗的反应特性相一致。比较清楚的了解了四株单抗的免疫学特性,为每株单抗供不同用途使用提供了理论依据。 根据单抗2H3免疫学特性,利用NCBI中BLAST功能比对单抗结合抗原区段氨基酸的差别,发现羊PrP208位点表现有种属特异性,推测此位点可能影响2H3免疫学特性;利用大肠杆菌原核表达系统表达含有2H3单抗结合区段的PrP肽段,在PCR引物中引入突变,将小尾寒羊PrP208位点的异亮氨酸Ⅰ突变为牛PrP208位点蛋氨酸M,与未引入突变的同一段小尾寒羊PrP肽段一起与2H3进行Western blotting反应,结果显示2H3不与突变后的PrP肽段发生反应,但与未引入突变的同一肽段发生反应。结果说明,2H3的主要抗原结合位点为羊208位点的Ⅰ,此位点的种属差异是造成2H3单抗具有免疫学特性的原因,结果同时也说明2H3在动物朊毒体蛋白研究上具有特殊意义。 在以上研究的基础上,本实验以自制单抗为核心试剂,优化各步骤反应的最佳条件,建立具有我国自主知识产权的羊痒病免疫组化检测方法,并采集我国部分省、市、自治区羊脑样品,利用建立的羊痒病免疫组化检测方法对我国羊痒病进行普查。在2005年检测的3211头份样品和2006年检测的1711头份样品中,所有4922头份检测样品均显示为阴性,初步说明我国目前尚无羊痒病的发生。
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