收藏本站
《南京农业大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

体细胞克隆山羊表观遗传修饰与基因表达特征研究

邢宝松  
【摘要】: 尽管体细胞核移植在许多物种中获得成功,但是获得表型正常克隆动物的效率却非常低。供体细胞核的不完全重序被认为是造成克隆胚胎不能正常发育到成年的首要原因。深入探讨成年体细胞克隆动物中潜在的表现遗传修饰机制,将有助于了解关于克隆动物能够正常发育的后成重序界限,强化SCNT中相关的伦理观念。本研究以成年体细胞克隆山羊为研究对象,运用同源扩增、PCR克隆测序方法获得山羊印迹基因差异甲基化(DMR)序列,并通过Southern杂交、实时定量RT-PCR、SSCP等技术,进一步探索了成年克隆山羊印迹基因、DNA重复序列的甲基化模式,端粒长度以及生长相关印迹基因和非印迹基因的表达特征,深入探讨甲基化对基因表达的调控模式。 1.山羊H19/IGF2和IGF2R第2内含子DMR的克隆测序与分析 本实验根据绵羊的DNA序列AJ566210保守区域设计引物扩增出山羊H19基因第一外显子上游长4.2kb的调控区域序列,经生物信息学分析,该序列具有和绵羊、人类和小鼠同样的结构(Genbank登录号:EF577239)。包含有4个锌指蛋白CTCF结合位点,分别定位于转录起始部位上游4079bp(Ⅰ)、3646bp(Ⅱ)、2866bp(Ⅲ)和1221bp(Ⅳ);4个CpG岛,GC含量分别为63%、65%、61%和71%;该序列与绵羊的参考序列同源度达93.5%。 根据绵羊DNA序列AY182033保守区域设计引物扩增出山羊IGF2R第二內含子DMR片段,并成功获得上游809bp和下游576bp序列(中间区域由于GC含量过高,无法测序;Genbank登录号:EF577240)。经BLAST分析确认,与所参照序列同区域同源度平均为95.7%,GC含量分别为76%和67%。 2.成年体细胞克隆山羊H19和IGF2R基因DMR甲基化状况分析 基因组DNA10μg用EcoRⅠ和甲基化敏感酶SacⅡ酶切后,与筛选出的H19基因上游特异性探针(地高辛标记)进行Southem杂交。结果表明,在H19基因上游DMR,成年体细胞克隆山羊甲基化程度均值(1.85±0.37)与年龄相近的对照组山羊均值(1.53±0.38)相比,差异不显著(p=0.16);但是就个体而言,克隆山羊只有一只甲基化水平不在对照组均值范围內;卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(1.84±0.39)与皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(1.90±0.47)基本接近,表明不同的供核细胞类型来源并没有对其甲基化状况有什么影响;皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值稍低于其供核体山羊。 为了检测成年体细胞克隆山羊IGF2R第2內含子DMR的甲基化状态,基因组DNA10μg用HindⅢ和甲基化敏感酶sacⅡ酶切,southern转移后与特异性探针杂交。结果表明,成年克隆山羊甲基化均值(4.46±1.67)与年龄相近的对照组山羊均值(2.34±1.28)相比,差异显著(P<0.05),表明成年克隆山羊IGF2R基因內含子差异甲基化区域甲基化水平显著高于同龄对照组动物;卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(4.54±1.91)与2只皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(4.19±0.99)基本接近,因此,在这个差异甲基化位点上,不同的供核细胞类型并没有对其甲基化状况影响不大;皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值则与其核供体山羊的甲基化程度相当。 3.成年体细胞克隆山羊小卫星DNA重复序列甲基化状况分析 基因组DNA 5μg平均分成2等份,分别用甲基化不敏感內切酶MspⅠ消化和甲基化敏感性限制酶HpaⅡ消化后与人源小卫星探针33.6杂交。结果表明,成年体细胞克隆山羊小卫星DNA重复序列甲基化程度与自然繁殖山羊相比差异不显著(P>0.05);成纤维细胞克隆山羊甲基化水平(6.17±1.46)少于颗粒细胞克隆山羊的均值(6.89±4.15),也低于其皮肤成纤维细胞供体山羊的7.96,但是颗粒细胞克隆变异系数较高(P<0.01)。 4.体细胞克隆山羊端粒长度分析 本实验用TRF法检测了成年体细胞克隆山羊端粒长度。结果表明,成年克隆山羊耳皮肤组织端粒平均长度与同龄对照相比,差异不显著(P>0.05),但是克隆山羊的变化范围较大;皮肤成纤维克隆山羊端粒长度略大于卵巢颗粒细胞;继代克隆山羊端粒长度略短于对照,但差异不显著(P>0.05)。说明核移植以及连续核移植对克隆山羊端粒长度影响不大。 5.成年体细胞克隆山羊生长相关印迹基因表达分析 本实验用Real-time PCR分析了成年体细胞克隆山羊印迹基因H19、IGF2和IGF2R mRNA表达情况。结果表明,克隆山羊和非克隆山羊H19基因和IGF2基因的表达并没有显著差异(P>0.05),而IGF2R基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊(P<0.01)。2只皮肤成纤维细胞克隆山羊H19和IGF2基因的表达明显低于颗粒细胞克隆山羊中的表达量,而IGF2R基因的表达在二者申的表达基本相同。同时本实验还H19和IGF2基因的定量PCR产物进行SSCP分析,结果表明,二者的单等位表达方式是一致的。 本实验还获得了山羊IGF2基因完整编码区和3’非翻译区。分析表明,山羊IGF2基因开放阅读框(ORF)长度为540bp,编码一个179氨基酸的蛋白。三种反刍动物相比,山羊IGF2 DNA序列与绵羊的同源性(99.47%)要高于牛(97.68%)。编码的氨基酸序列与绵羊同源性(98.88%)也高于牛(96.09%)。山羊IGF2基因GenBank登陆号为DQ645739。同时还获得山羊H19和IGF2R基因部分序列,GenBank登陆号分别为:DQ666955和DQ666954。 6.成年体细胞克隆山羊生长相关非印迹基因表达分析 本实验用Real-time PCR分析了成年体细胞克隆山羊非印迹基因IGF1、IGF1R、GHR和GHSR mRNA表达情况。结果表明,克隆山羊和非克隆山羊IGF1、GHR和GHSR基因的mRNA表达量差异不显著(P>0.05),而IGF1只基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊(P<0.01)。本实验同时还获得山羊IGF1R基因部分序列,GenBank登陆号为:DQ666953。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 肖嵘;丁艳;陆前进;李亚萍;李勇坚;杨心洁;苏玉文;梁云生;张桂英;文海泉;;5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响[J];中南大学学报(医学版);2006年06期
2 王理;上官少方;马晓红;张霆;;利用分子量阵列平台进行特定序列甲基化分析的方法探讨[J];现代生物医学进展;2011年04期
3 金京波;;DNA甲基化和类Dicer蛋白是拟南芥继代胁迫适应过程中所必需的[J];农业生物技术学报;2010年04期
4 刘姝;蔡彦宁;陈彪;;C57 BL/6J小鼠肝脏中mPer1基因CpG岛甲基化分析[J];中国现代医学杂志;2009年12期
5 陈海燕;马保华;刘洁;赵晓娥;曹宇静;雷晓华;;密闭培养条件下小鼠早期胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化状态分析[J];中国生物化学与分子生物学报;2010年07期
6 荣美洁;李兰;董文娟;闵令江;潘庆杰;;崂山奶山羊乳腺中孕激素受体基因甲基化与基因表达关系的研究[J];青岛农业大学学报(自然科学版);2010年03期
7 熊卿圆;熊兴东;刘新光;周中军;;MBD4/MED1的结构与功能[J];生命的化学;2011年04期
8 赵炳云;王淑一;张术森;藏博;;浅谈DNA甲基化的分析技术[J];中国畜禽种业;2009年11期
9 冯福德;王树;;DNA甲基化检测研究新进展[J];科学通报;2009年02期
10 王秀奇,李大海,何忠效;模板甲基化水平对鼠肝RNA聚合酶体外转录活性的影响[J];北京师范大学学报(自然科学版);1994年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李遇梅;李政亮;马红;许辉;刘莉萍;赵建华;;两种实时定量PCR方法检测DNA甲基化状态的比较研究[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年
2 郭金;陈晓丽;雷云平;邹继珍;卢晓琳;包怡华;吴丽华;吴建新;郑晓英;沈一平;吴柏林;张霆;;神经管畸形胚胎脑组织DNA整体甲基化水平的病例对照研究[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编(上册)[C];2010年
3 徐晓;王美美;肖传实;;类风湿关节炎患者基因组DNA甲基化水平的初步研究[A];第十届全国风湿病学学术会议论文集[C];2005年
4 丛广志;贾绍斌;罗彩琴;王义勇;张政军;侯建军;刘静;;Hhcy诱导大鼠LINE-1序列低甲基化作用研究[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年
5 张心菊;顾小叶;马玮哲;关明;;高分辨率熔解技术定量检测前列腺癌DLC-1启动子甲基化水平[A];全国临床免疫检验研讨会暨第六届全国临床免疫学术会议论文汇编[C];2009年
6 吴凤岐;权力;苏改秀;朱佳;王芳;赖建铭;王理;黄小兰;袁新宇;张霆;;儿童系统性红斑狼疮的临床与基础研究[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编(上册)[C];2010年
7 黄焱磊;郑珊;;孕期叶酸影响胎鼠肛门直肠发育畸形的实验研究[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年
8 王春国;古瑜;宋文芹;焦定量;孙德岭;;西瓜同源多倍体化后基因组DNA甲基化水平与模式研究[A];中国园艺学会十届二次理事会暨学术研讨会论文摘要集[C];2007年
9 朱小华;徐金华;李锋;项蕾红;;SLE患者CpG基序甲基化状态与LFA-1表达的研究[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年
10 张鹏;苏玉文;陆前进;;寻常型银屑病外周血单一核细胞及皮损基因组DNA甲基化水平改变[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;世界上第2例体细胞克隆山羊降生[N];新华日报;2000年
2 支勇平 储国强;世界首例成年体细胞克隆山羊当奶奶[N];中国知识产权报;2003年
3 记者 吴仲国;日首只体细胞克隆山羊问世[N];科技日报;2000年
4 记者 杨文斌 于小晗 通讯员 易同民;第二只体细胞克隆山羊“阳阳”降生[N];科技日报;2000年
5 王燕宁 张晔;相聚南京 共商发展[N];科技日报;2000年
6 宋清源;报道克隆山羊生死始末第一人[N];解放军报;2000年
7 记者晏燕;我们克隆的牛羊又多又壮[N];科技日报;2002年
8 支勇平 记者 张哲浩;我国体细胞克隆山羊四代同堂[N];科技日报;2004年
9 本报记者 吴洁;拷贝“金矿”[N];科技日报;2001年
10 记者 王世焕;元元 阳阳确为体细胞克隆获得[N];新华每日电讯;2000年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 邢宝松;体细胞克隆山羊表观遗传修饰与基因表达特征研究[D];南京农业大学;2007年
2 郭继彤;成年体细胞克隆山羊研究[D];西北农林科技大学;2000年
3 张吉才;乙型肝炎病毒相关肝癌p16~(INK4A)/RB途径相关基因异常甲基化及机制[D];华中科技大学;2007年
4 刘金毅;EcoRII R-M基因在大肠杆菌中的表达及EcoRII(M)特异性甲基化对正常和肿瘤细胞的影响研究[D];中国协和医科大学;1999年
5 朱小华;CpG基序甲基化状态及其调控因素在SLE发病机制中的作用研究[D];复旦大学;2009年
6 李亚萍;Gadd45a在CD4~+T细胞基因病理性低甲基化及系统性红斑狼疮发病中的作用[D];中南大学;2009年
7 金贺;结直肠癌Tiam1基因异常甲基化的研究[D];南方医科大学;2009年
8 邹亚学;5’调控序列的甲基化水平及siRNA对端粒酶活性的影响[D];吉林大学;2007年
9 王畅;急性白血病相关基因甲基化异常的研究[D];吉林大学;2008年
10 姚凡;胰液中相关基因高甲基化检测在胰腺疾病诊断中的应用研究[D];中国医科大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李宏伟;基因启动子甲基化与前列腺癌的相关性研究[D];第四军医大学;2009年
2 赵宸;髓系白血病骨髓有核细胞中Wnt5a启动子区域甲基化状态及其与白血病发生关系的研究[D];第三军医大学;2010年
3 李利义;胃癌中Runx3基因启动子甲基化及其蛋白表达研究[D];浙江大学;2007年
4 王艳瑜;金属硫蛋白-3在食管癌中的表达及其CpG岛超甲基化研究[D];河北医科大学;2007年
5 杨晓芹;SLE患者外周血T淋巴细胞IL-13Rα1基因表达及其调节序列甲基化状态的研究[D];中南大学;2007年
6 俞媛;人源肝癌裸鼠模型甲胎蛋白基因甲基化模式对基因表达的影响[D];河北医科大学;2008年
7 王聪慧;非小细胞肺癌中TMS1基因甲基化检测及临床意义[D];安徽医科大学;2008年
8 吴春利;胆囊癌中DAPK、P16/INK4a、P14和hMLH1基因甲基化状态的研究[D];安徽医科大学;2009年
9 邓刚;Wnt5a在白血病中的表达及其启动子区域甲基化的研究[D];第三军医大学;2008年
10 黄国良;维甲酸(RA)诱导F9干细胞分化过程中甲胎蛋白基因表达及其甲基化[D];汕头大学;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026