六种天蚕素类基因工程抗菌肽的研制及应用

【摘要】： 抗生素的滥用不仅导致了药物残留等公共卫生隐疾，而且由于耐药菌株的出现，使得细菌性疾病的防治再次成为困扰人类的难题。一种全新抗菌药物的开发已经成为当代微生物学家、医药学家和兽医工作者的主攻课题。抗菌肽由于其广谱高效抗菌活性及独特的抗菌机制而在新型抗菌药物研究中显露明显优势。 抗菌肽(Antibacterial peptides，ABP)是生物体产生的一种阳离子小肽，多数具有广谱抗菌活性，是生物先天性免疫的重要组成成份。仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。近20年来，人们对昆虫抗菌肽已进行了比较系统的理论和应用研究。但有关畜禽抗菌肽基因工程应用研究方面的报道较少。本研究的目的就是应用基因工程研制出具有自主知识产权的六种天蚕素类重组基因工程抗菌肽，以及作为一种添加剂对鸡肠道正常微生物菌群的影响。为重组抗菌肽的工业化生产奠定基础。研究主要从以下几个方面展开： 1．选用毕赤酵母偏爱密码子，通过SOE法合成抗菌肽Cecropin B基因，并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆Cecropin B并将3个亚克隆串联在一起，每个单体前都加上Kex2酶切位点，将cecropin B及其串联体克隆至表达载体pPICZα-A上，用SacI酶切使之线性化后，采用电击法转化酵母SMD1168，转化子用小瓶发酵。经Tricine-SDS-PAGE检测，在α信号因子的引导下，表达产物可以分泌到培养基中，初步抑菌活性试验显示，二者对金黄色葡萄球菌和耐氨苄青霉素的大肠杆菌有较好的抑杀活性。从抑菌直径来看，串联体并不像预计的那样比单体的抑菌直径大3倍，单从表达量方面分析不足以说明3个单体都得到了表达，这可能与毕赤酵母的表达条件有关，也可能与Kex2酶切位点的酶切效果有关。其具体原因还有待于进一步的研究和探讨。 2．根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA，CA)N端第1-7个氨基酸残基，马盖宁(magainin，M)N端第2-12个氨基酸残基，以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1-7)-M(2-12)基因，同载体pPICZα-A连接后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168，在醇氧化酶(AOX)启动子调控下，分子量约1.9kD的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达，抗菌特性研究表明，该表达产物具有广谱抗菌活性，对多数G-菌及G~+菌均有较好的抑菌活性。在以上研究结果的基础上，参考相关天蚕素类抗菌肽的作用机制以及抗菌肽结构与功能关系的假说，设计了杂合肽cecA-mag的三个突变体并利用重组聚合酶链式反应定点诱变技术，使突变体得以合成，利用琼脂孔扩散法检测cecA-mag和其突变体对金黄色葡萄球菌的抑菌效价。试验结果显示，三个突变体的抑菌活性比cecA-mag分别提高了1.2、1.2、1.5倍。 3．毕赤酵母SMD1168菌株由于蛋白酶A和羧肽酶Y活性全部缺失，仅存部分蛋白酶B活性，该特性非常有利于发酵液中重组抗菌肽表达物的稳定，较之x-33、GS115两种酵母菌株，更适合表达抗菌肽之类的生物活性小肽，本实验选用SMD1168毕赤酵母菌株表达cecropinB以及其串联体基因和cecA-mag的三个突变体基因抗菌肽。对上述六种重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了表达优化，结果表明重组酵母菌在BMGY培养基中增殖OD_(600)为5～6时转接BMMY培养基；BMMY培养基pH值为6.0，28℃培养60h；补加1.0％甲醇；可提高重组抗菌肽的表达量和抗菌活性。抑菌试验，证明重组基因工程抗菌肽对G~+和G~-均具有良好的活性。酸碱稳定性实验结果显示，所表达的重组抗菌肽在pH等于3.5时仍然有很好的活性，热稳定性实验显示，重组抗菌肽100℃加热5min，仍有活性，基于这样的特性该抗菌肽有望在饲料和食品添加剂中得到很好的应用。重组抗菌肽的体外稳定性试验显示，所研制成功的六种基因工程抗菌肽在4℃到保存30天仍有良好的活性，从而提示4℃是其最佳的保存方式。目前为止，还没有对抗菌肽的单位有权威的最后报道，表达量的高低也不能简单的等同为活性的强弱，所以笔者认为浓度单位可能是恰当的用来衡量其活性的方式，所以对研制成功的六种基因工程抗菌肽单位应用MIC来初步表示。大肠杆菌的MIC的测定结果发现：cecA-mag、cecA-mag-mu-1、cecA-mag—mu-2、cecA-mag-mu-3、cecB、3×cecB对大肠杆菌的MIC分别为：0.92、0.73、0.75、0.69、0.5、0.41,μM。在此基础上对合成的六种基因工程抗菌肽的抗菌谱进行了完善。对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用通过其生长曲线有了系统的了解，通过曲线显示对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在cecB和cecA-mag在40μg mL~(-1)的使用剂量下上述两种细菌得到完全抑制! 4．以普通1日龄莱杭蛋雏鸡为研究对象，将120只雏鸡分为6个组，每组20只，其中不同剂量抗菌肽治疗组又分为口服和肌肉注射两个不同的处理，每个处理10只。研究了重组抗菌肽CecropinB治疗雏鸡大肠杆菌感染的效果。通过预试验，初步确定了选用的大肠杆菌对雏鸡的最小致死剂量(MLD_(100))为1×10~7个细菌。最小致死剂量(1×10~7个细菌／mL)大肠杆菌肌肉注射24h后，肌肉注射和口服不同浓度的重组cecropinB抗菌肽，连续治疗5天。结果表明，重组抗菌肽cecropinB对大肠杆菌有较好的治疗效果。其中高剂量(0.75mL)的口服组的效果最佳，其治疗效果要优于市面上出售的兽用盐酸环丙沙星效果，治愈率达到80％，中剂量(0.5mL)的口服组与高剂量肌肉注射组的治愈率相同为70％。中剂量肌肉注射组与环丙沙星组效果一致，治愈率达到60％，低剂量抗菌肽治疗组，治疗效果不如上述的所有治疗组，说明所研制的基因工程抗菌肽在治疗大肠杆菌感染时存在一定的剂量依赖关系。与感染对照组相比，所有组别的雏鸡死亡率显著降低，抗菌肽高、中、低剂量组的有效率、治愈率与环丙沙星组差异不显著。 5．抗菌肽作为生物体先天性免疫的主要组成成份，在抵御外来病原侵袭中发挥着重要作用，特别是两栖类和昆虫类，缺乏高效精确的细胞免疫系统，所以抗菌肽就成了其免疫防御系统的关键成份。抗菌肽对细菌、真菌、病毒、原虫及癌变细胞都具有广泛的杀伤活性。将250羽健康蛋雏鸡随机分成5组，每组50羽，其中盐酸环丙沙星组为抗生素对照组，空白对照组不添加任何成份，合成的基因工程抗菌肽cecropinB高、中、低三个剂量以饮水混饮的方式饲喂，高中低剂量分别为2、4、8ml L~(-1)对实验各组鸡的免疫器官指标以及体重增重进行了测试和分析，结果表明，所选用的抗菌肽高中低剂量组都不同程度的增强了鸡的平均日增重，不同剂量之间差异显著(P＜0.01)，对雏鸡免疫功能的增强作用通过脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数三个指标得以体现，以高剂量组的增强作用最为明显。此外，对基因工程抗菌肽cecropinB对鸡巨噬细胞的吞噬能力进行了探讨。SPSS统计结果表明，高剂量组吞噬率与其它各组比较，差异显著(P＞0.05)；高剂量组吞噬指数与药物对照组比较，差异显著(P＞0.05)，总体看来，实验组的吞噬率和吞噬指数高于对照组，尤其是高剂量组吞噬率和吞噬指数明显高于对照组，吞噬率和吞噬指数是巨噬细胞吞噬功能的具体表现，从而说明基因工程抗菌肽cecropinB可以提高鸡巨噬细胞的吞噬能力。这一研究结果为基因工程抗菌肽的进一步应用奠定了基础。 6．动物肠道内栖息着复杂多样的微生物区系，该区系对宿主的生长、健康具有重要意义。为研究cecropinB对雏鸡肠道微生物区系的影响，试验将250只1日龄雏鸡随机分成五个处理组，每个处理组50只，试验组以混饮的方式饲喂不同浓度的cecropinB，对照组也以混饮的方式饲喂盐酸环丙沙星，空白对照组饮水中不添加任何成份。用量和饲喂方法同上。分别于42、49d取盲肠、回肠内容物进行PCR-DGGE，对肠道的几种优势菌的多样性进行了研究。分析结果表明，饲喂含cecropinB对雏鸡盲肠、回肠中微生物种群种类未产生明显的影响，各组鸡肠道中微生物种群类型既具有一定的相似性，又存在一定的差异。对回肠内容物16SrDNA进行克隆、测序显示，饲喂cecropinB的高剂量组比空白对照组多了一条与厌气弯杆菌同源性为78％的条带，其具体原因和机理还有待于进一步的研究。试验结果显示，CecropinB作为一种饲料添加剂在试验期内对雏鸡肠道微生物区系没有产生明显的影响。这也是国内外首次基因工程抗菌肽对雏鸡正常微生物菌群影响的相关报道。

【关键词】：抗菌肽 基因改造 大肠杆菌 Pichia pastoris 肠道微生物区系
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S852.5
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