不结球白菜温敏型胞质雄性不育的分子标记和相关基因的克隆与表达分析
【摘要】：
以不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)温敏型(Pol)胞质雄性不育系04p20及其保持系04p21为材料，分析其雄性不育相关的生理生化特性，对其基因组DNA进行RAPD、AFLP和SSR分析，并对胞质雄性不育相关基因进行克隆和表达分析，以求进一步探明胞质雄性不育的分子机理，为进一步利用温敏型(Pol)胞质雄性不育奠定了基础。主要研究结果如下：
1不结球白菜温敏型胞质雄性不育的生理生化特性
对不结球白菜温敏型(Pol)胞质雄性不育系及其保持系的生理生化特性研究结果表明：不育系不同大小的蕾和花中可溶性糖、可溶性蛋白质和脯氨酸以及游离态、结合态和束缚态的精胺、亚精胺、腐胺含量均显著低于其保持系，而在叶片中三种形态的多胺含量无差异；孢原细胞分化期雄性不育系花蕾中多胺含量显著低于保持系，显示多胺含量不足可能与不结球白菜Pol胞质雄性不育系小孢子发育受阻有关；SOD、POD和CAT活性则是不育系高于其保持系；POD同工酶电泳分析也发现不育系POD含量及其活性高于其保持系，这些结果表明上述物质含量和酶活性与不结球白菜Pol胞质雄性不育相关。
2对不结球白菜温敏型胞质雄性不育系及其保持系基因组DNA进行RAPD、AFLP分析
用386条随机引物对不育系及其保持系的基因组DNA进行RAPD分析，其中346条引物在两系中都得到了扩增产物，62条引物的扩增结果在两系之间表现出了遗传多态性。在不育系中获得特异片段OPAY1000，序列测定OPAY1000序列全长为1053bp，在GenBank中的登录号为DQ320101。此序列编码175个氨基酸，在NCBI上用tblastx软件进行相似性检索后发现其与拟南芥苏氨酸肽链内切酶有76个氨基酸相似，相似性为55％。根据序列测定结果设计了一对特异引物，将OPAY1000转化成SCAR标记。
用72对AFLP引物组合对不育系及其保持系的基因组DNA进行AFLP分析，筛选与雄性不育相关的特异片段。经过重复验证，得到三条特异片段BrCMS1、BrCMS2、BrCMS3，对这些特异片段进行克隆测序分析表明：BrCMS1和油菜的一个反转录基因有90％的相似性，与拟南芥一号染色体的BAC F1106有90％的相似性；BrCMS2与日本水稻的一个cDNA克隆全长的部分氨基酸有58％的相似性；BrCMS3与甘蓝克隆A的全序列有93％的相似性。Southern点杂交结果与AFLP分析结果一致。这3个序列在GenBank的登录号分别为DQ513189、DQ513190和DQ513191。本研究揭示了不结球白菜Pol胞质雄性不育系和其保持系在核DNA上存在差异。
3不结球白菜温敏型胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的比较分析
对不育系和其保持系的线粒体DNA进行RAPD分析，结果表明：在285条引物的扩增产物中，不育系和保持系线粒体DNA之间存在差异，在不育系中获得两条特异带AY1200和RD800，序列分析发现RD800序列与贝氏柯克斯体QpH1质粒全基因组序列的132个氨基酸有47％的相似性；AY1200与拟南芥的铁氧化还原蛋白依赖的谷氨酸盐合成酶的65个氨基酸有33％的相似性，此结果显示不育系和保持系线粒体基因组间存在差异。
4不结球白菜温敏型胞质雄性不育系叶绿体DNA的SSR分析
从36对烟草叶绿体SSR引物中筛选出10对能用于不结球白菜的叶绿体SSR引物，应用这10对引物对不育系和保持系的叶绿体基因组进行SSR分析。结果显示两系间扩增片段的多态性较小，获得了一条在不育系出现的特异片段。克隆测序表明此特异片段的核苷酸序列含T碱基的11次重复，与烟草叶绿体基因组DNA的148bp片段有98％的相似性。此结果显示不育系和保持系叶绿体基因组间存在差异，此差异也许与Pol胞质雄性不育相关。
5不结球白菜温敏型胞质雄性不育相关基因的克隆及其表达分析
根据GenBank中Brassica rapa的orf224和atp6基因的保守序列设计特异引物对不结球白菜温敏型(Pol)胞质雄性不育系的基因组DNA进行特异扩增，获得了Pol胞质雄性不育的特异基因orf224c和atp6c的DNA序列。用tBlastx在GenBank中进行相似性比对分析，发现不结球白菜orf224c和atp6c基因与已报道的orf224和atp6基因的相似性高达100％，在GenBank中的登录号依次为DQ400846、DQ412559。运用半定量RT-PCR对orf224c基因在不同器官中的表达水平进行分析，结果表明：不育系花期叶片中该基因的表达量比幼蕾(长度小于0.5mm)和雄蕊中的明显低，在幼蕾和雄蕊中的表达量无明显差异；而在保持系的上述3个器官中的orf224c基因表达量无明显差异。该结果显示orf224c基因表达上调与孢原细胞分化受阻相关。
6不结球白菜温敏型胞质雄性不育系及其保持系蕾期基因表达差异的SRAP分析
用新型DNA指纹技术SRAP对不结球白菜温敏型(Pol)胞质雄性不育系及其保持系蕾期基因的差异表达进行研究，在30对SRAP引物对不育系和保持系cDNA的扩增产物中，不育系有2条稳定的特异片段。对特异片段克隆测序分析发现，BcCMS1与大白菜控制细胞生成染色体的19个氨基酸有63％的相似性，BcCMS2与芥蓝控制开花的基因flc3部分碱基有88％的相似性，显示BcCMS1、BcCMS2可能与胞质雄性不育相关。成功尝试了将SRAP技术用于基因差异表达研究。
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