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《南京农业大学》 2007年
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砂梨果实成熟相关基因的克隆及其RNAi载体的构建

胡钟东  
【摘要】: 砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)原产于我国中部、南部和西部各省,适于在温暖多雨地区栽培,是原产于中国的四个梨栽培种之一,具有耐热、抗旱、抗火疫病等优良性状。但其果实大多贮藏性差。如何提高果实耐贮性是解决好砂梨产业化的关键问题。目前的研究主要是针对砂梨果实的生理特点,通过改善果实的贮藏条件和采用一些乙烯抑制剂来延长砂梨果实的货架期,不能解决根本问题。我们以‘若光'梨为材料,研究适于‘若光'梨叶片离体再生的培养基的种类以及激素配比,克隆‘若光'果实中与成熟相关的基因并构建其RNA干扰载体,将构建的载体分别进行农杆菌介导的梨、番茄、烟草转化,研究干扰基因在植物体内的表达特性,为将来获得耐贮砂梨新种质提供了基础。 1、为了获得‘若光'梨高效的叶片离体再生体系,和为‘若光'梨的耐贮基因工程研究提供条件,以‘若光'梨叶片为材料,研究了不同激素的种类与浓度组合对砂梨叶片离体再生的影响。结果发现,以NN_(69)为基本培养基,附加TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.15 mg/L+AgNO_3 0.1 mg/L处理‘若光'梨叶片,暗培养21d后,再置于光照条件下培养30d,‘若光'梨叶片不定芽再生频率达到了63.2%。 2、根据已登录的砂梨ACO3(GenBank Accession No.AB042107)序列设计并合成一对特异引物,以‘若光'梨叶片总DNA为模板,利用染色体步移技术扩增基因的上游调控序列。回收该片段并克隆到pMD19-T载体上,测序后去除接头和基因编码序列,得到一段长715bp的上游序列。登陆PLACE数据库在线进行植物DNA顺式作用元件预测与分析,起始位点的上游89bp处有一个TATA-Box核心启动子元件。另外,序列还存在多个特异调控基因表达的元件。初步判断其为砂梨果实中ACC氧化酶基因的诱导型启动子。 3、以‘若光'梨成熟果实为材料,提取总RNA。在ACC氧化酶基因(ACO)mRNA序列同源性较高区域,用Primer premier5软件设计一对特异引物,利用RT-PCR克隆得到了401bp长的片段。经过测序和核苷酸、氨基酸比对,发现与登录的ACC氧化酶基因(ACO3)同源性达到99%。据此判断,得到的片段为砂梨的ACC氧化酶基因序列。根据序列设计两对分别加了不同酶切位点的正、反基因的特异上下游引物,扩增出ACO的正、反义基因。将ACO反义基因、与副球菌中类胡萝卜素合成有关的间隔基因YYT(GenBank with accession number AY345165)以及ACO正义基因三个片段串联在一起,并克隆到T载体。经测序鉴定正确后,双酶酶切下目标片断并插入到植物表达载体中,构建成能够表达ACC氧化酶基因的双链RNA的植物载体pYF028。 4、为了研究ACO干扰基因在植物体中的表达特性,通过农杆菌介导法转化番茄子叶,将侵染的520个外植体先经MS+ZT 1mg/L+IAA 0.5 mg/L+Km 50 mg/L+250 mg/LCef+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH 5.8)筛选培养基,初步筛选出Km抗性芽。将筛选出的抗性芽再经过2次继代培养,共得到34个抗性株系。将抗性株系转到生根培养基MS+IAA 0.5 mg/L+Km 50 mg/L+Cef250mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7g/L(pH5.8)中生根,经过30d的生根培养,共得到了6个生根株系。经过GUS染色、PCR、RT-PCR检测验证。初步证实,干扰基因已经整合到番茄的基因组中。进一步进行其乙烯发生量的检测,结果发现,转干扰基因番茄植株的乙烯释放量显著高于对照。 5、以‘若光'梨成熟果实为材料,提取总RNA并反转录成cDNA。根据脂氧合酶氨基酸保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR克隆到1段长827bp的cDNA序列。经Blast比对和DNAstar软件聚类分析,结果表明,由该序列推导出的氨基酸序列含有脂氧合酶氨基酸保守结构域,与马铃薯脂氧合酶基因的氨基酸序列相似性达到77.5%。判断为砂梨脂氧合酶基因片段,命名为LOX1,并将序列登录到GenBank,登录号为EF215448。根据RNAi载体的构建原则,选择LOX1中一开放阅读框设计携带酶切位点的特异引物,通过PCR扩增LOX1正、反向基因片段,再与YYT间隔区串连,插入植物表达载体pYF7713中的相应位置。构建了干扰砂梨LOX基因表达的RNAi植物双元表达载体pYL028。 6、为了研究干扰基因在植物体中的表达特性,我们将构建好的‘若光'梨LOX1干扰表达载体(pYL028),通过农杆菌介导法转化烟草叶片;将侵染的113个外植体先经MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+Km 50 mg/L+Cb 250 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH 5.8)的筛选培养基培养,初步筛选出Km抗性芽。抗性芽再经2次继代培养,共得到16个抗性株系。将抗性株系转到1/2MS+IBA 0.1 mg/L+Cb 250 mg/L+Km 50 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH 5.8)的生根培养基中生根,经过30d的生根培养,共得到了5个生根株系。经过GUS染色、PCR、RT-PCR检测验证,初步证实,干扰基因已经整合到烟草的基因组中。进一步检测脂氧合酶及相关酶的活性,结果显示,在低温胁迫条件下,转基因植株与未转基因的对照植株相比,LOX酶的活性被抑制37.8%;SOD、CAT和POD酶活性显著升高。MDA的含量显著降低。 7、根据脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)氨基酸保守区设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从‘若光'梨成熟果实中克隆到一段eDNA特异片段,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑单克隆测序,得到了两段长度均为827bp,编码275个氨基酸残基的核苷酸序列,经BLAST分析,由序列推导的氨基酸序列含脂氧合酶基因氨基酸保守结构域,据此推断得到的片段为砂梨脂氧合酶基因家族中的2个新成员,分别命名为LOX2、LOX3,并登录GenBank(EF215449,EF215450)。经DNAStar软件分析,结果显示砂梨果实中表达的LOX2基因可能与果实种子发育有关,而LOX1和LOX3基因为砂梨果实胁迫条件下诱导表达的基因。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S661.2

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【引证文献】
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1 李海;农杆菌介导DSACO基因转化‘明水’梨的研究[D];南京农业大学;2009年
2 音建华;枇杷离体培养及其在遗传转化与种质保存中的应用[D];福建农林大学;2010年
【参考文献】
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2 颜志梅,盛宝龙,蔺经,李晓刚,杨青松;不同保鲜膜对翠冠梨贮藏效果的影响[J];保鲜与加工;2005年03期
3 饶景萍,童斌,中野龙平,稻叶昭次;柿果实ACC合成酶cDNA的克隆及其序列分析[J];西北植物学报;2001年05期
4 韩清芳,徐凌飞,马锋旺,王喆之,任小林;梨叶柄再生不定芽的研究[J];西北植物学报;2002年06期
5 王利军,范三红,郭蔼光;拟南芥ats1A基因启动子的克隆和功能分析[J];西北植物学报;2004年10期
6 叶霞;丛郁;陶建敏;渠慎春;章镇;;超声波介导铁蛋白基因转化苹果的研究[J];西北植物学报;2006年10期
7 李昌珠,Sedlak Jiri,Jan Blazek;不同基因型欧洲梨离体繁殖研究[J];果树学报;2002年04期
8 刘翠琼,汤浩茹;梨叶片培养与转基因研究进展[J];果树学报;2003年05期
9 曹霞,柴明良;砂梨叶片再生不定梢的研究[J];果树学报;2005年05期
10 娄晓鸣,章镇,姚泉洪,熊爱生,王化坤,彭日荷,李贤;乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因在转基因苹果中表达[J];果树学报;2005年06期
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 刘丹;农杆菌介导ASACC基因转化苹果的研究[D];南京农业大学;2004年
2 周泳;农杆菌介导的铁贮藏蛋白基因转化翠冠梨的研究[D];南京农业大学;2005年
【共引文献】
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1 薛炳烨,束怀瑞;应用基因工程改良果实成熟特性研究进展[J];山东农业科学;2002年04期
2 孙清荣,樊圣华,刘庆忠;大鸭梨叶片高频率不定梢再生诱导研究[J];山东农业科学;2003年02期
3 隋娜,李萌,田纪春,孟庆伟,赵世杰;K~+对水分胁迫下超级小麦幼苗生理特性的影响[J];山东农业科学;2004年06期
4 于惠敏;侯丙凯;;番茄基因工程及生物反应器研究与开发进展[J];山东农业科学;2007年02期
5 郭淼;张廷婷;高建强;崔德才;;拟南芥PLDα1突变体的繁殖及形态和生理特性分析[J];山东农业科学;2007年02期
6 黄霄;杨秀梅;刘训言;孟庆伟;;转正义基因番茄类囊体膜脂不饱和度对抗旱性的影响[J];山东农业科学;2008年03期
7 邢瑞丹;刘庆忠;陈新;李亚东;;两个蓝莓品种离体叶片不定芽再生体系的建立[J];山东农业科学;2009年05期
8 张晓东;李利斌;宋宜现;李化银;刘立峰;高玲;高建伟;;大白菜高效稳定遗传转化体系的建立[J];山东农业科学;2010年02期
9 李铭韧;史国安;;牡丹花瓣脂氧合酶测定方法的研究[J];山东农业科学;2010年09期
10 姜虎生;张思洋;王宏燕;;跳龟灵、对硫磷乳剂对玉米生理指标的影响[J];山东农业科学;2011年06期
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1 赵晓莉;聂琼;谢深喜;;逆境下植物茉莉酸的生理作用及其他生物合成研究进展[A];园艺学文集5[C];2010年
2 陈宇;黄志明;叶美兰;吴锦程;;不同枇杷品种果实发育过程中果肉细胞壁组分的变化[A];第五届全国枇杷学术研讨会论文(摘要)集[C];2011年
3 傅明连;林素英;蔡丽琴;黄志明;吴锦程;;不同枇杷品种细胞壁代谢与果肉质地形成的关系[A];第五届全国枇杷学术研讨会论文(摘要)集[C];2011年
4 常尚连;张立宾;;农杆菌介导西瓜转基因提高糖度的研究[A];山东园艺学会第七次会员代表大会暨学术研讨会论文集[C];2011年
5 李婷婷;张秀新;吕英民;;盆栽芍药有机生态型无土栽培基质配方筛选[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年
6 王磊;卓丽环;李瑞发;;农业废弃物作为百子莲组培苗移栽基质的研究[A];中国球根花卉研究进展2011[C];2011年
7 乌云塔娜;康秀;马腾;;中国梨醇-酰基转移酶(AAT)基因的克隆及遗传多态性[A];梨科研与生产进展(五)[C];2011年
8 宗娟;朱立武;贾兵;;黄冠梨茎尖离体培养再生体系建立初探[A];梨科研与生产进展(五)[C];2011年
9 孙清荣;孙洪雁;辛力;张力思;刘庆忠;;梨二倍体和秋水仙碱诱导产生的多倍体植株形态特征比较[A];梨科研与生产进展(五)[C];2011年
10 王文辉;王志华;丁丹丹;佟伟;张志云;贾晓辉;姜云斌;;1-MCP对不同温度下圆黄、黄金和丰水梨保鲜效果的影响[A];梨科研与生产进展(五)[C];2011年
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2 王延秀;浓缩单宁合成的分子调控及紫花苜蓿遗传转化研究[D];甘肃农业大学;2010年
3 黄俊骏;DNA甲基转移酶基因的表达和花粉母细胞DNA的甲基化[D];兰州大学;2010年
4 李玉华;高山离子芥再生苗响应低温和干旱的生理机制研究[D];兰州大学;2010年
5 曾卫军;拟南芥(Arabidopsis thaliana)受胁迫因子诱导激活启动子的筛选及其应用研究[D];华东师范大学;2011年
6 田娜;农杆菌介导的猕猴桃遗传转化及AtNHX1转化植株抗盐性分析;拟南芥At4G12490基因对逆境的抗性功能研究[D];西北大学;2010年
7 李惠华;龙眼体胚发生过程中激素代谢和信号转导相关基因的克隆与表达[D];福建农林大学;2010年
8 张妙霞;野生香蕉(Musa spp., AB group)抗寒相关基因的克隆与表达分析[D];福建农林大学;2010年
9 盖玉红;盐生和中生植物对盐害的响应及其抗性结构机制研究[D];东北师范大学;2010年
10 赵宇瑛;黄瓜磷脂酶D和抗氧化系统对采后机械损伤胁迫的响应[D];浙江大学;2011年
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1 李智;梨抗黑星病类似基因Hcrp和启动子克隆与类受体蛋白分析[D];华中农业大学;2010年
2 张帆;dsRNA介导的番木瓜环斑病毒(PRSV)的抗病性研究[D];华中农业大学;2010年
3 刘红梅;农杆菌介导百子莲抗寒基因CBF1高效转化体系的建立[D];华中农业大学;2010年
4 魏礼玲;MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究[D];华中农业大学;2010年
5 刘冉冉;枫香遗传转化体系的优化及转化PaFT基因的研究[D];华中农业大学;2010年
6 殷巍;澳大利亚扇子花Scaevola crassifolia的繁殖技术研究[D];华中农业大学;2010年
7 梁梅荣;澳大利亚扇子花Scaevola nitida R.Br的组织培养研究[D];华中农业大学;2010年
8 姚秋林;水稻根特异表达启动子的克隆及功能分析[D];华中农业大学;2010年
9 田芳;甘蓝型油菜A8连锁群含油量QTLs及其遗传累赘分析[D];华中农业大学;2009年
10 龚文芳;棉花抗细胞凋亡基因GhDAD1的克隆、定位及表达分析[D];华中农业大学;2010年
【同被引文献】
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1 薛炳烨,束怀瑞;应用基因工程改良果实成熟特性研究进展[J];山东农业科学;2002年04期
2 孙清荣,樊圣华,刘庆忠;大鸭梨叶片高频率不定梢再生诱导研究[J];山东农业科学;2003年02期
3 王玉民,吴伟;活性氧代谢与油桃成熟衰老机理[J];安徽科技;2004年04期
4 万小荣;李玲;;植物ACC合成酶的分子生物学[J];安徽农业科学;2007年03期
5 侯春霞;王永清;李俊强;邱源;袁媛;;根癌农杆菌介导的枇杷花药胚状体遗传转化中抗生素种类和浓度的研究[J];安徽农业科学;2007年16期
6 陈红;王永清;;枇杷花药培养诱导愈伤组织的研究[J];安徽农业科学;2007年27期
7 周静亚;徐忠传;张保龙;何晓兰;;AP70抗病基因转化番茄的研究[J];安徽农业科学;2008年13期
8 张进献;李冬杰;张广华;李青云;葛会波;;不同钙处理对采后草莓果实细胞壁酶活性、果胶含量的影响[J];北方园艺;2006年02期
9 李军;王文雅;郭函子;胡小松;;油桃果实成熟过程中脂质过氧化相关酶活性变化研究[J];北方园艺;2006年05期
10 张红梅;智庆文;张凤英;于新惠;刘小红;李润植;;番茄基因工程的研究进展[J];北方园艺;2007年06期
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1 徐章逸;两种葡萄卷叶伴随病毒的基因克隆、原核表达及葡萄遗传转化体系的初步建立[D];华中农业大学;2006年
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1 刘月学;枇杷种质离体保存的初步研究[D];福建农林大学;2002年
2 刘小军;枇杷种质离体保存及生理生化研究[D];福建农林大学;2003年
3 曹艳红;苹果多酚氧化酶双链RNA干扰(dsRNAi)研究[D];南京农业大学;2004年
4 周泳;农杆菌介导的铁贮藏蛋白基因转化翠冠梨的研究[D];南京农业大学;2005年
5 沈庆斌;枇杷高频率体胚发生体系的建立及其遗传转化初步研究[D];福建农林大学;2005年
6 陈辉;百合种质离体保存技术研究[D];华中农业大学;2005年
7 黄玉吉;根癌农杆菌介导的ACS反义基因和PEAS基因转化香蕉研究[D];福建农林大学;2006年
8 孟芮;农杆菌介导的百合ACC氧化酶反义基因遗传转化研究[D];西北农林科技大学;2006年
9 瞿金旺;根癌农杆菌介导亚精胺合成酶基因MdSPDS1的柑橘遗传转化及离体再生[D];华中农业大学;2006年
10 周莉莉;多酚氧化酶基因dsRNAi导入丰水梨的研究[D];南京农业大学;2006年
【二级引证文献】
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1 刘敏;中国水仙ACS和ACO cDNA全长克隆、ACS反义表达载体构建及遗传转化研究[D];福建农林大学;2012年
2 荣霞;橄榄离体种质保存及其分子机制的研究[D];福建农林大学;2012年
3 林鹤延;转基因兰花培养物继代保持及文心兰ACO基因克隆与表达分析[D];福建农林大学;2012年
【二级参考文献】
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5 孙希生,王文辉,李志强,王志华,张志云;1-MCP对砀山酥梨保鲜效果的影响[J];保鲜与加工;2001年06期
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8 张晓国,刘玉乐,杨清平,田波;水稻花药特异启动子Osg6B的序列及功能分析[J];西北植物学报;2000年05期
9 饶景萍,童斌,中野龙平,稻叶昭次;柿果实ACC合成酶cDNA的克隆及其序列分析[J];西北植物学报;2001年05期
10 侯文胜,郭三堆,路明;sgna基因小麦高效表达载体的构建[J];西北植物学报;2002年05期
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1 刘丹;农杆菌介导ASACC基因转化苹果的研究[D];南京农业大学;2004年
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1 徐长宝,沈志军;砂梨和日本梨生态适应性的探讨及展望[J];果树学报;2000年04期
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4 曾芳;聂庆华;谢亮;张细权;;鹌鹑CGI-58基因编码区的克隆与序列分析[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
5 隋兆峰;刘文强;范伟兴;许传田;赵宏坤;;鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛交叉保护性研究及其FimA基因的克隆与序列分析[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
6 单振菊;邓晓玲;郭恒;冯旭祥;;柑桔黄龙病病原β-操纵子DNA片段的克隆与序列分析[A];2005年中南、西南植物病理学会和中国菌物学会联合学术年会论文集[C];2005年
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9 宫磊;张文娜;李天忠;;梨编码DELLA蛋白的GAI基因克隆与序列分析[A];梨科研与生产进展(五)[C];2011年
10 顾万军;梁金华;林小敏;黄良宗;王淑敏;冼琼珍;;胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA毒力基因的克隆与序列分析[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(上)[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 张爱虎;企业家不懈追求[N];湖北日报;2011年
2 姚桂林;谁为梨农解忧?[N];中国工商报;2003年
3 记者 张爱虎;与市场握手[N];湖北日报;2011年
4 本报通讯员 姚桂林;谁为梨农来解忧?[N];市场报;2003年
5 老河口市人民政府;培育“汉水”品牌 壮大砂梨产业[N];湖北日报;2010年
6 肖正华;南方砂梨3年新增产值35亿元[N];中国绿色时报;2011年
7 主持人 江河;主攻梨品经济效益[N];江苏农业科技报;2004年
8 记者 胡左;我国培育出转基因耐贮藏河套蜜瓜[N];科技日报;2001年
9 通讯员 罗宏;枝江砂梨入列农产品国家重点区域规划[N];三峡日报;2009年
10 郑兆山;订单蔬菜富了熊桥村[N];中华合作时报;2003年
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1 胡钟东;砂梨果实成熟相关基因的克隆及其RNAi载体的构建[D];南京农业大学;2007年
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6 孟颢光;砀山酥梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)转入抗病相关基因VpSTS和VpPR10的研究[D];西北农林科技大学;2011年
7 刘焕涛;脂氧合酶抑制剂NDGA对乳腺癌细胞MCF-7生物学特性的影响及其机制探讨[D];山东大学;2004年
8 刘宏;脂氧合酶抑制剂NDGA抑制腺样囊性癌生长的实验研究[D];第二军医大学;2007年
9 余义勋;根癌农杆菌介导的ACC氧化酶基因转化香石竹的研究[D];华中农业大学;2004年
10 章家长;P_(SAG12)-ipt基因导入延缓中华结楼草衰老研究[D];中国农业大学;2005年
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1 陈敏敏;不结球白菜离体培养再生体系的优化及抗病转基因研究[D];南京农业大学;2007年
2 周婷;猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及M蛋白基因克隆与序列分析[D];四川农业大学;2005年
3 邵爱华;暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)线粒体DNA的分离纯化及其几个重要基因的克隆与序列分析[D];苏州大学;2005年
4 王磊;柞蚕及家蚕卵黄原蛋白基因的克隆与序列分析[D];安徽农业大学;2006年
5 黄道超;大熊猫γ-干扰素基因克隆、原核表达及真核表达载体构建[D];四川农业大学;2007年
6 马伟;PRRSV-XJPRRSV1/03株结构蛋白基因的克隆与序列分析[D];新疆农业大学;2008年
7 刘芳;广西高致病性猪繁殖与呼吸综合征的流行病学调查及其病毒ORF5、ORF6、ORF7基因的克隆与序列分析[D];广西大学;2008年
8 袁曦;中国荷斯坦奶牛β-防御素基因LAP分子克隆及真核表达初步研究[D];四川农业大学;2009年
9 王铮;鸡减蛋综合征病毒河北株分子生物学研究及pVⅢ基因的克隆与序列分析[D];河北农业大学;2006年
10 刘毅;来自易变山羊草抗禾谷孢囊线虫基因的克隆与序列分析[D];中国科学院研究生院(成都生物研究所);2006年
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