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猪圆环病毒2型感染分子诊断与防制的相关研究

潘群兴  
【摘要】: 猪圆环病毒感染是由猪圆环病毒2型(PCV2)引起的_种新传染病,母猪表现为繁殖障碍,仔猪和断奶猪主要特征为猪体质下降,消瘦,呼吸困难,咳喘,腹泻和黄疸等。PCV2与多种猪病相关,主要引起仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、繁殖障碍、猪呼吸道综合征、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴腺炎、渗出性皮炎和仔猪先天性震颤等。尤其PMWS,该病最早于1991年在加拿大西部发现,其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等,病原学及血清学调查表明,该病在包括我国在内的许多国家都广泛存在,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。本论文主要是对PCV2感染的分子诊断方法、PCV2基因工程疫苗以及不同硒源对PCV2体外复制的影响与机理进行了研究,其目的是为PCV2感染的诊断与防制提供技术支撑和科学依据。主要内容如下: 试验1.猪圆环病毒2型、细小病毒及伪狂犬病毒多重PCR方法的建立 猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病(PRV)是引起母猪繁殖障碍的重要致病因素。为了解临床上这三种疾病的混合感染并进行鉴别诊断,本文建立了一种同时检测PCV2、PPV、及PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法。根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp(PCV2)、581 bp(PPV)、372bP(PRV gB)及147bp(PRV gE)四条特异性片段。对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出PCV2 10ng、PPV和PRV gB、gE分别为10~(-6.2)、10~(-3.8)、10~(-5.8)TCID_(50)的模板。 试验2.猪圆环病毒2型实时定量PCR检测方法的建立 利用PCR技术扩增PCV2 ORF2保守区基因107 bp片段并克隆到pMD-19-T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准样品,以10倍梯度稀释的标准样品为模板,进行荧光定量PCR,并绘制标准曲线。建立的实时定量PCR方法,起始模板浓度与Ct值之间呈很好的线性关系,标准曲线斜率为-0.32,相关系数r2=0.997,Ct值在11.9和26.9之间。PCV2能扩出S型荧光曲线,熔解曲线的峰狭窄单一,而PCV1、PPV和PRV均不能扩出。对32份健康猪和32份PMWS可疑猪样品定量检测:健康猪阳性率为44%(14/32),病毒载量均小于10~4拷贝·μL~(-1);PMWS可疑猪阳性率96.8%(31/32),病毒载量均大于10~5拷贝·μL~(-1)。 试验3.猪圆环病毒2型ORF2基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立 根据GenBank中猪群圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计特异性引物,回收PCR产物,将其克隆入pMD18-T载体,再定向克隆到表达载体pET-32a中并转化大肠杆菌Rosetta,进行原核表达。表达产物经His-Bind蛋白纯化试剂盒纯化,平均浓度为1.10mg·mL~(-1)。以1.8μg·mL~(-1)蛋白包被酶标板,建立ELISA检测方法。建立的ELISA方法,与北京世纪元亨公司试剂盒比较,符合率达85%以上。用该方法对常州某猪场36份母猪和156份10-160日龄猪群血清抗体进行了检测,检测结果显示母猪抗体阳性率为81.4%,仔猪抗体阳性率随着日龄的增加,阳性率逐渐降低,后由于受PCV2的感染,阳性率逐渐升高。本文建立的ELISA方法,具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于猪群PCV2抗体的大规模检测。 试验4.重组圆环病毒2型Cap蛋白基因的猪细小病毒VP2病毒样粒子的构建与鉴定 利用PPV VP2病毒样粒子作为一种抗原转运载体,将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白第165-200位氨基酸多肽嵌合在猪细小病毒(PPV)VP2 N端,然后重组到腺病毒pAdEasy-1表达系统中,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒(rAd-△Cap-△VP2)。通过空斑纯化,测定其TCID_(50)为10~(11.5)·mL~(-1)。IFA和Western-blotting分析分别可见特异性荧光和大小约为64 kDa的特异性带,表明rAd-△Cap-△VP2在HEK-293细胞中成功地表达了PPV:△VP2和PCV2:△Cap蛋白。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合蛋白具有与全病毒类似的血凝活性。电镜观察嵌合蛋白的粗提物,发现可自行装配成病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]。 试验5.共表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及白细胞介素-2的重组腺病毒的构建与鉴定 本研究利用PCR技术将PCV2 Cap蛋白基因和IL-2-Cap融合基因分别克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasy~(TM))共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap和rAd-IL-2-Cap。测定其TCID_(50)为10~(10.6)·mL~(-1),10~(10.2)·mL~(-1)。利用RT-PCR、IFA、间接ELISA、Western-blotting等方法以及IL-2 ELISA试剂盒分别检测猪圆环病毒2型Cap蛋白和IL-2的体外表达情况,结果证实两基因在腺病毒中获得了表达。该研究为研制PCV2基因工程疫苗奠定了基础。 试验6.重组腺病毒免疫特性的研究 本研究通过小鼠试验分别观察了重组腺病毒rAd-△Cap-△VP2,rAd-Cap和rAd-Cap-IL-2的免疫特性。取120只6-8周龄的清洁级ICR小鼠,随机分为四组,每组30只,第1组每只小鼠皮下注射10~(10)TCID_(50)重组腺病毒rAd-△Cap-△VP2;第2组每只小鼠皮下注射10~(10)TCID_(50)重组腺病毒rAd-Cap,第3组每只小鼠皮下注射10~(10)TCID_(50)rAd-Cap-IL-2,第4组每只小鼠皮下注射10~(10)TCID_(50)空的腺病毒(wild Ad),两周后按相同方法加强免疫1次,隔离饲养,并分别在首免后0,14,28,35,42,49和56天,每组取4只小鼠宰杀,采集血清,测定PCV2特异性ELISA抗体和中和抗体;同时无菌取其脾脏,进行淋巴细胞转化试验。结果为前3组免疫小鼠在二免后14天都能检测到PCV2 ELISA杭体,抗体水平随着时间逐渐升高,在二免后35天时ELLSA杭体水平达最高分别为1:10000,1:6000和1:9600,PCV2中和抗体平均滴度分别为1:16,1:10和1:12;同时,第1组免疫小鼠血清中PPV中和抗体达1:20。第4组免疫小鼠在免疫后均未检测到ELISA杭体和中和抗体。Western blotting试验结果表明,免疫小鼠血清中存在PCV2特异性杭体。淋巴细胞转化试验结果为首免后42和56天前3组小鼠Con A/LPS刺激指数不同程度升高。上述结果表明,重组腺病rAd-△Cap-△VP2,rAd-Cap和rAd-Cap-IL-2可以诱导小鼠产生明显的体液免疫和细胞免疫应答,rAd-△Cap-△VP2免疫效果更显著。 试验7.不同硒源对猪圆环病毒2型体外感染的影响 本试验在已建立的PCV2型实时定量PCR方法检测技术基础上,研究亚硒酸钠、硒蛋氨酸和海藻硒多糖等三种不同硒源对PCV2体外复制的影响。结果表明:三种不同硒源对猪圆环病毒2型在PK-15中的复制呈现不同程度的抑制作用,其中硒蛋氨酸抑制作用显著,在2-16μmol·L~(-1)范围内,浓度愈大,抑制作用愈强,呈剂量依赖性关系。三种不同硒源均能不同程度增强细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活力,其中硒蛋氨酸增强作用显著,提示,硒抗病毒复制的作用主要是通过清除自由基和抗氧化作用来完成的。


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