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蛹虫草纤溶酶的分离纯化、酶学性质及溶栓抗栓作用研究

崔莉  
【摘要】: 血栓性疾病包括急性心肌梗死,缺血性心脏病,心血管疾病,心脏瓣膜病,周边血管疾病,心律失常,高血压等,日渐成胁着人类的健康。世界卫生组织(WHO)2000年的统计数据表明,心血管疾病已经占全世界死亡率的29%。鉴于此,溶栓抗栓药物的研制开发已成为国内外研究热点之一。目前用于血栓性疾病治疗的药物都不同程度具有纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺点。于是,国内外专家学者,逐渐将目光投向寻找一些安全性好、副作用小、疗效好的天然来源的溶栓药物。 虫草菌是我国传统名贵中药,属子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草菌属(Cordyceps(Frey)Link.),是一种虫生真菌;在民间,常常被称为冬虫夏草。药理学研究表明在增强免疫力,抗肿瘤,抗细菌和抗真菌等方面具有良好功效;蛹虫草因与冬虫夏草有着相似的结构和功能,近年来备受各界关注。迄今为止,蛹虫草是否具有纤溶功能还未见报道。 本研究首次筛选到一株产生高活性纤溶酶的SN-18菌株,进行了形态和分子鉴定;优化了培养条件和培养基组成,进而对蛹虫草纤溶酶进行分离纯化,研究了酶学性质以及体内和体外的溶栓抗栓功能,为进一步研究与应用开发提供了必要的工作基础和科学依据。主要研究结果如下: 一、纤溶活性菌株SN-18的分离鉴定及产纤溶酶发酵特性研究 1.根据菌丝形态,分生孢子形态以及人工培养产生的子座形态对分离筛选到的具有最强的纤溶活性编号为SN-18菌株进行鉴定,初步推测为蛹虫草。 2.对基因组DNA的ITS1-5.8S-ITS2区域的PCR产物测序,将测序结果运用Blastn程序与GenBank中的核酸序列进行比对分析,筛选与SN-18同源性较高的典型菌株构建系统发育进化树。根据序列相似性分析结果得知:菌株SN-18与蛹虫草C.miitarisAY899258和蛹虫草拟青霉Paecilomgces militaris DQ342250、DQ342248具有相当高的同源性,相似性达100%,结合形态鉴定的结果可以判断SN-18就是蛹虫草。 3.采用单因素试验法确定了SN-18产纤溶酶的最佳培养基组成和培养条件:培养基组成为面粉1%,蚕蛹粉5%,接种量10%;培养条件为转速160r/m,装液量30mL/250mL,温度25℃,培养时间为6天。发酵液纤溶酶活力达到32.34U/ml,是未优化前的PDA液体培养基的2.31倍。 二、蛹虫草纤溶酶的分离纯化和酶学性质 1.蛹虫草液体发酵液离心,获得粗酶液,粗酶液经硫酸铵分级沉淀后,收集活性成份,经凝胶层析达到电泳纯。 2.酶活最适pH和最适温度为pH 6.0和25℃。Mg~(2+)和Fe~(2+)促进酶活,EDTA和Cu~(2+)抑制酶活。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,得出单一条带,其近似分子量为27.3kDa。N端氨基酸序列为IVGGVSVAIE(Swiss prot登录号P85318) 三、蛹虫草纤溶酶溶栓、抗栓作用研究 1.溶栓作用实验表明: 蛹虫草纤溶酶具有直接降解纤维蛋白的纤溶活性。 体外对毛细管血凝块溶解实验结果为:毛细管血凝块于37℃培养3h后,蛹虫草纤溶酶(12U/ml)组的溶解率为29.49%,与生理盐水空白对照组(3.01%)差异显著(P<0.01)。注入蛹虫草纤溶酶的毛细管由于其中的血凝块被溶解而使管内的溶液变红,血凝块明显变短变细,而且在管内随液体滑动,阻塞消除。而空白对照则保持阻塞状态。 体外对血凝块溶解实验结果为:蛹虫草纤溶酶分别取24U/ml、24U/ml、12U/ml、6U/ml四个浓度,以尿激酶12U/ml为阳性对照和生理盐水为空白对照,各取8ml,在37℃,90r/min条件下,12小时之内,考察对0.5g的血凝块的溶解率。结果为24U/ml、12U/ml、6U/ml三个浓度对血凝块的溶解率分别为99%、53.4%、14.2%、8.6%和4.4%,且三个浓度组呈量效关系。24U/ml浓度组在12h后,试管中完全看不到血凝块,其溶解后的微粒悬浮在试管中,使试管内液体由澄清变混浊。而尿激酶12U/ml阳性对照组,还可以看到成型的血凝块,溶液的颜色和做为空白的生理盐水组相近,还较澄清。 2.抗栓作用实验表明: 蛹虫草纤溶酶粗制液在体内8 min之内就对大鼠血小板性动脉血栓形成具有明显的抑制作用,蛹虫草纤溶酶中剂量组(ⅳCMase 12 U/kg)在体内对大鼠血小板性动脉血栓形成的抑制作用与尿激酶(ⅳ250U/kg)相当,二者差异不显著;中(ⅳCMase 12 U/kg)、高剂量(ⅳCMase 18 U/kg)给药组与空白对照组有显著差异(P<0.01),并且三个给药组呈量效关系。 蛹虫草纤溶酶粗制液在体内8 min之内就对ADP诱导的大鼠血小板聚集具有明显的抑制作用,蛹虫草纤溶酶中剂量组(ⅳCMase 12 U/kg)对ADP诱导的大鼠血小板聚集的抑制作用与尿激酶(ⅳ500U/kg)相当,二者差异不显著。中(ⅳCMase 12U/kg)、高剂量(ⅳCMase 18 U/kg)给药组与空白对照组有显著差异(P<0.01),并且三个给药组呈量效关系。


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