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农杆菌介导苹果PPO基因dsRNAi转化‘丰水’梨的研究

甘惠芳  
【摘要】: 砂梨果实在加工和切割的过程中普遍存在的褐变问题,给广大果农和果商带来巨大的经济损失。虽然通过多种手段获得了比较满意的抑制褐变的效果,但是随之带来的负面效果也很多。培育抗褐变的品种是解决这一问题的根本途径之一。在已建立‘丰水'叶片不定芽再生体系的基础上,我们以‘丰水'梨为材料,以苹果多酚氧化酶双链RNA为目的基因,通过农杆菌介导方法转化‘丰水'梨,以期获得抗褐变的转基因砂梨。实验内容和研究结果如下: 1、我们研究继代培养基对本实验室保存的‘丰水'梨组培苗生长发育的影响;再以不同继代培养基上培养的叶片为材料,研究叶片生理状态以及氨苄青霉素(Amp)、羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)和卡那霉素(Km)4种抗生素对不定芽再生的影响。结果表明,以AS为基本培养基,附加BA 0.5mg/L+NAA0.1 mg/L适合‘丰水'梨继代培养,以该配方继代培养21d~32d的叶片不定芽再生率达92.21%~95.38%。在农杆菌介导的‘丰水'梨遗传转化中,单纯考虑杀菌剂对‘丰水'梨叶片再分化的影响,可使用100~300mg/L的Amp、或100mg/L Carb、或100~300 mg/L的Cef,10mg//L为Km筛选的临界浓度。 2、我们以‘丰水'梨组培苗叶片为外植体,通过试验初步确定‘丰水'梨遗传转化体系为:农杆菌菌液浓度OD_(600)=0.4~0.5,以含75μmol/L乙酰丁香酮(AS)的NN_(69)O,pH5.5为悬浮液活化菌株,叶块浸染8min后吸干,置于含75μmol/L乙酰丁香酮(AS)的再生培养基上黑暗共培养4天,综合考虑3种抗生素对叶片再分化的影响和对农杆菌抑制效果,我们认为200mg/L~300 mg/L Amp或Cef是理想的杀菌剂,附加杀菌剂延后培养3d,再转入附加杀菌剂和10mg/LKm的选择培养基上黑暗培养21d,再光照培养至不定芽长出。从转化的2019个外植体中获得了16个不定芽,平均不定芽再生率为0.79%。 3、‘丰水'梨组培苗叶片按照第三章的体系进行转化试验,延迟培养时间由3d延长至21d,再转入附加10mg/LKm的选择培养基上光照培养至不定芽长出,抗性芽率为4.91%。对获得的8株Km抗性芽进行GUS组织化学染色,结果显示AG180-2和AG180-4为GUS阳性植株;PCR检测初步证实AG180-1、AG180-2、AG180-3、AG180-4等4个株系基因组中已整合APPO基因dsRNAi;RT-PCR检测,证实株系AG180-2中的APPO基因dsRNAj已在转录水平表达。多酚氧化酶(PPO)活性测定结果表明,株系AG180-2的多酚氧化酶(PPO)活性比对照极显著降低了49.45%。可见,将苹果PPO基因双链RNA导入苹果中和导入梨中的效果有差异,这可能是由于导入了异源的PPO基因,导致双链RNA的干扰效果变差。


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