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我国大豆资源豆腐豆乳得率和异黄酮含量的遗传变异及两类性状的QTL分析

王春娥  
【摘要】: 灵芝在中国被用来统称Ganoderma这一属的药用真菌,它自古以来就被认为是一种名贵药材,可以延年益寿。今天灵芝仍被广泛作为一种保健品和药品,灵芝的药理和营养研究证明它的确含有一定的活性成分可以对一些疾病起到预防和治疗的作用,如高血压、糖尿病、肝炎、癌症和艾滋病。 随着灵芝人工栽培的成功,灵芝子实体、菌丝体以及相关产品被广泛用作功能性食品和药品。但由于灵芝的菌种鉴定和分类工作远远不够,造成灵芝的生产用菌种比较混乱,种属归属的不确定性往往会造成研究结果的错误或不同解释,这是灵芝研究和质量控制存在的一个严重问题。色谱指纹图谱技术为中草药鉴定和质量控制提供了一个新的合理的解决途径,近几年已经应用这种方法对很多中草药进行了鉴定。虽然已经有应用HPLC方法对灵芝进行分类的研究.,但还没有应用指纹图谱技术对中国栽培灵芝菌种进行资源调查性质的研究。灵芝的生产研究目前还主要是产量、性状方面的基础研究,我们把HPLC技术引入到灵芝的生产研究中,从灵芝子实体三萜成分、菌丝体三萜成分的角度进行了比较,对指导灵芝的生产具有新的意义。指纹图谱研究的高级阶段是把化学指纹图谱和药效相结合,这也是中草药指纹图谱亟待解决的问题。本文应用灰色关联度分析的方法初步把灵芝三萜指纹图谱和三萜药效结合起来。 本文共分六个部分,分别从HPLC指纹图谱在灵芝分类上的应用,相似度分析软件的建立,模式分类研究,菌丝体三萜提取物HPLC指纹图谱和药理指纹图谱的建立,HPLC指纹图谱技术在灵芝实际生产中的应用和灰色关联度分析六个方面进行了研究。主要结果如下: 1灵芝三萜指纹图谱的构建 建立了灵芝子实体三萜的提取条件:1 g样品中加95%乙醇至50 mL静置过夜,过滤,上清蒸干,加甲醇定容至1.5 mL,10000×g离心5 min,过滤,取上清液1 mL上反相色谱柱。HPLC色谱条件:反相色谱柱(YMC-Pack ODS-AQ,5μm,250 mm×4.6mm i.d.YMC,Japan);流动相由A、B两部分组成,A为含1%冰醋酸的超纯水,B为色谱级甲醇,A:B=52:48,流速:1.0 mL/min,柱温:30℃。检测波长250 nm,检测时间90 min。获得了所有供试菌株的HPLC色谱图,对所有菌株进行了分类研究,105个菌株被分成20类,建立了分类组A、B的标准HPLC指纹图谱,为以后的质量控制工作建立了标准。 3、对NJRIKY群体干豆腐和豆乳得率两个年份及两年平均值的分离分析与QTL定位结果表明:干豆腐与干豆乳得率遗传均属两对主基因加多基因混合遗传模型,主基因遗传率13.23%-26.84%,多基因遗传率73.15%-86.77%。定位到不同年份稳定表达的干豆腐得率的2个QTL,贡献率累计为16.23%-23.18%,1个控制干豆乳得率的QTL,贡献率为4.73%-7.14%。分离分析和QTL定位的结果相对一致,可相互校验,均表明干豆腐与干豆乳得率受主基因加多基因控制,微效基因占主导地位,其遗传改良更多需要依靠多基因积聚。 4、利用Agilent 1100高效液相色谱(HPLC)(Zorbax SB-C18柱与DAD检测器)系统,建立了15 min内12种大豆异黄酮组分分离良好的定量分析流程,各组分峰面积与其相应浓度均呈良好线性关系(r为0.9995-0.9999),加标回收率均大于99%,日内与日间相对标准差(RSD)(或误差变异系数ECV%)分别为0.17-2.74%与0.24-3.95%.经5700多份样品检测验证,其RSD5%,该方法具有简便、精确、快速与稳定特点. 5、983份大豆种质籽粒12种异黄酮组分含量及其总含量的遗传变异结果表明:(1)中国野生大豆和栽培大豆籽粒多数存在12种异黄酮组分,各组分占异黄酮总含量的比重在不同材料中均有差异,野生种与地方品种均以大豆苷类异黄酮较高,平均分别为46.81%和35.40%;育成品种以黄豆苷类异黄酮较高,平均为48.00%。(2)全国野生大豆、地方品种与育成品种籽粒异黄酮总含量平均分别为2994.51、3241.33和2704.83μg g~(-1),变幅分别为927.29-7932.94、259.38-7725.45和547.49-5735.15μg g~(-1)。地方品种在野生豆基础上平均增加了246.82μg g~(-1),育成品种在野生豆基础上平均减少了289.68μg g~(-1),这种增减体现在大豆苷类总含量分别减少了233.08与975.64μg g~(-1),染料木苷类总含量分别增加了211.83与217.83μg g~(-1),黄豆苷类总含量分别增加了268.07与468.15μg g~(-1),表明以产量为主要改良目标的育成品种,明显降低了大豆苷类含量,导致育成品种的异黄酮总含量平均低于野生种.(3)各生态区均存在与全国相似的变异情况,区内变异大于区间变异。(4)野生种大豆异黄酮总含量与种质来源地经纬度无显著性相关,栽培种与经度(r为-0.264)、纬度(r为-0.380)均极显著负相关,表明大豆籽粒异黄酮含量与来源地本不相关,各区利用方向的差异形成了与地理经纬度微弱的相关性. 6、NJRIKY群体两年大豆籽粒12种大豆异黄酮组分含量及其总含量的分离分析与QTL定位结果表明:大豆籽粒异黄酮总含量和各组分含量的遗传均属2-3对主基因加多基因混合遗传模型,主基因遗传率为16.42%-45.08%,多基因遗传率为54.78%-83.44%.定位到不同年份稳定表达控制大豆异黄酮含量的QTL 28个以上,单点贡献率为3.90%-13.21%.其中,异黄酮总含量的2个QTL,累计贡献率为15.55%-15.60%,26个异黄酮组分的QTL,均与总含量的QTL位点不同,说明异黄酮组分的QTL因贡献率不高无法体现在总含量QTL上。分离分析与QTL定位结果相对一致,均表明大豆籽粒异黄酮遗传改良需更多依靠基因积聚。 7、两年NJRIKY群体籽粒大豆异黄酮含量在豆腐加工产品中转移的联合统计分析发现:每克大豆籽粒加工成豆乳,其总异黄酮14.85%在豆渣中、85.15%在豆乳中、由豆乳加工豆腐,豆腐中只有17.32%,其余67.83%进入黄浆水;豆腐中只有10种异黄酮,未检测到乙酰基染料木苷(AG)与乙酰基黄豆苷(AGL)。不同家系异黄酮总含量及其12种组分在各产品中分配均有很大差异,异黄酮总含量的变幅在豆乳中为78.93%-88.70%、豆腐中为5.61%-43.03%、黄浆水中为38.67%,-81.45%,说明加工产品大豆异黄酮含量的改良潜力大。 8、对NJRIKY群体2004与2005两个年份干豆乳和干豆腐中12种异黄酮组分含量及其总含量的分离分析与QTL定位结果表明:(1)干豆乳中各异黄酮含量的遗传属2-3对主基因加多基因混合遗传模型,主基因遗传率为29.66%-49.27%,多基因遗传率为50.59%-70.20%。定位到不同年份稳定表达豆乳中异黄酮组分含量的QTL 12个,单点贡献率为4.09%-13.51%;单个年份表达的豆乳中异黄酮总含量的QTL4个,贡献率为4.74-6.95%。(2)干豆腐中10种异黄酮组分含量及其总含量的遗传均属2对主基因加多基因混合遗传模型,主基因遗传率9.27%-47.50%,多基因遗传率52.37%-90.60%.定位到不同年份稳定表达豆腐中大豆异黄酮含量的QTL 10个,单点贡献率为4.08%-20.06%,其中2个豆腐中异黄酮总含量的QTL,其累计贡献率小于20%。分离分析与QTL定位均表明大豆豆乳与豆腐中异黄酮含量属主基因加多基因控制,多基因占主导地位(遗传率大于50.00%),其遗传改良应重视多基因积聚。 9,优选出南农大黄豆(干豆腐得率DT与干豆乳得率DM分别为79.95和92.87 g100 g~(-1))、扶隆豆(DT与DM分别为85.89和88.66 g100g~(-1))、ZYD3621(异黄酮总含量为7932.94μg g~(-1))、N3208(大豆苷类总含量为4901.83μg g~(-1))、N23602(染料木苷类总含量为3747.24μg g~(-1))、N20793(黄豆苷类总含量为5122.21μg g~(-1))等共计40份高豆腐、高豆乳得率与高含异黄酮的特异种质,可直接用于生产、新品种选育与遗传研究。


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