大豆丙二烯氧化物合酶基因（GmAOS）的克隆和功能研究

【摘要】： 大豆食叶性害虫是影响大豆产量和品质的因素之一,本研究采用室內喂养斜纹夜蛾的方法,利用网室內采集的58份大豆资源的叶片,室內喂养相同龄期的斜纹夜娥幼虫.根据虫体的反应,以幼虫重和蛹重为指标,研究了大豆对斜纹夜蛾单一虫种的抗性.综合2004和2005年的鉴定结果,获得了稳定性较好的高抗品种(黄皮小青豆、山东大豆、P1229358)和高感品种(徐疃大豆、沔阳白毛豆、枞阳猴子毛).为克隆抗虫基因、鉴定基因功能以及研究大豆对斜纹夜蛾抗生性的遗传提供稳定可靠的抗、感材料. 本研究利用RACE的方法从大豆中克隆了茉莉酸生物合成的关键酶GmAOS基因及其启动子。GmAOS基因全长1789 bp,包含完整的ORF,编码519个氨基酸,没有內含子,GmAOS基因序列上有多个丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化位点,GmAOS基因在大豆不同抗性的材料中均有2个拷贝数;软件分析显示,GmAOS基因蛋白质等电点8.97,分子量58.3 KDa,具有典型叶绿体定位信号肽,其二级结构主要由p折叠和α螺旋构成。GmAOS启动子区有2个TATA-box,1个CAAT-box,1个响应赤霉素的作用元件(TAACAA)、1个响应可诱导性抗性基因的作用元件(Wbox),2个响应细菌和盐诱导的作用元件(GAAAAA)和1个茉莉酸诱导表达所必须的顺式元件(G box)。 利用对斜纹夜蛾表现高抗、高感的大豆材料,检测了GmAOS基因及其同源基因GmAOS1(ABB917763)在不同抗性材料中组织表达量的差异和不同胁迫诱导表达量的差异.GmAOS基因和GmAOS1基因在黄皮小青豆(高抗)和徐疃大豆(高感)的根、茎、叶,茎尖中都有表达,但是GmAOS基因和GmAOS1基因在黄皮小青豆(高抗)中的表达量比在徐疃大豆(高感)中的表达量高。GmAOS基因和GmAOS1基因对非生物胁迫冷(4℃)/热(45℃)/JA/SA/CuSO_4/Cu和生物胁迫SMV/Cotton worm均有响应;斜纹夜蛾诱导时,GmAOS和GmAOS1基因达到最大表达量在黄皮小青豆(高抗)中需要3小时,而GmAOS基因达到最大表达量在徐疃大豆(高感)中需要24小时,GmAOS1基因需要12小时.酶活测定表明,AOS在黄皮小青豆(高抗)中的酶活约为在徐疃大豆(高感)中的4倍.该结果显示,GmAOS和GmAOS1基因在不同抗性材料中的表达量不同,斜纹夜蛾诱导时达到最大表达量所需要的时间不同,AOS在不同抗性材料中的酶活性不同,这些差异可能是黄皮小青豆(高抗)与徐疃大豆(高感)抗性不同的原因,AOS基因可能与植株的抗虫性有密切关系,利用GmAOS基因提高材料的抗虫性具有可行性. 为了鉴定GmAOS基因是否与材料的抗虫性有直接关系,利用过量表达GmAoS基因的方法得到了转基因烟草,Souther blot分析显示GmAOS基因以2-4个拷贝形式随机插入到烟草基因组中。昆虫生物学实验显示,在斜纹夜蛾对寄主的选择实验中,自由取食的20头斜纹夜蛾,喂养15小时后,有16头斜纹夜蛾选择了对照烟草,4头斜纹夜蛾选择了转基因烟草,且对照的叶面损失大于转基因叶面损失,该结果表明,斜纹夜蛾更喜欢啃噬对照叶片而避开转基因叶片;强迫饲喂实验中,转基因烟草喂养的斜纹夜蛾的相对增长率全部降低于对照,且对照烟草的叶面损失大于转基因烟草叶面损失。茸毛密度和形态分析显示,同一视野中,转基因烟草叶片上的平均茸毛数为60.2个,对照烟草叶片上的平均茸毛数为10.2个,即转基因烟草叶片上的平均茸毛数是对照烟草叶片上平均茸毛数的6倍,差异达到极显著水平;茸毛形态有明显差异,与对照茸毛相比,转基因烟草叶片上的茸毛要更加圆润、饱满、坚硬。酶学实验测定显示,与对照烟草相比,有90%转基因烟草提高了AOS酶活性;各有70%转基因烟草提高了POD和PPO酶活性;85%转基因烟草提高了CI酶活性.激素测定显示,与对照烟草相比,85%转基因烟草提高了內源茉莉酸含量;所有转基因烟草均提高了内源脱落酸的含量;有85%转基因烟草提高了赤霉素含量;转基因烟草提高了吲哚乙酸的含量也有一定提.以上结果表明GmAOS基因在提高大豆的抗虫性申起到了重要作用,可做为候选基因用于提高材料抗虫性进行抗虫育种.