收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

猪乳铁蛋白的分离纯化及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

曹海军  
【摘要】: 乳铁蛋白(Lactoferrin,简称LF)是一种多功能的糖蛋白,主要存在于哺乳动物的乳汁、眼泪等外分泌物中,乳汁尤其是初乳中LF的含量最高。LF不仅具有广谱的抗菌和抗病毒的作用,而且还能够增强机体抗感染、抗肿瘤和免疫能力。 通过30%饱和硫酸铵沉淀、50%饱和硫酸铵沉淀、85%饱和硫酸铵沉淀——三步沉淀法和一步肝素琼脂糖亲和柱亲和层析进行天然猪乳铁蛋白的分离纯化,SDS-PAGE分析表明,获得的猪乳铁蛋白的相对分子量为80kDa。分别用制备的天然猪乳铁蛋白免疫鸡和兔子,制备高免血清,建立了测定猪乳铁蛋白的双夹心酶联免疫法(ELISA),并将该法运用于分离纯化天然猪乳铁蛋白各步骤,计算出了猪乳铁蛋白最终得率与纯度:65.6%,91%。 Pichia pastoris表达系统是近年来迅速发展起来的一种真核表达系统。Pichiapastoris是一种甲醇酵母,可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。在表达外源蛋白时,不仅具有原核生物生长快、操作简便、成本低的特点,而且具备哺乳动物的翻译后加工修饰的功能,从而表达出有生物活性的外源蛋白。 应用RT-PCR方法获得小型猪乳铁蛋白(pLF)基因,将其插入到pMD19-T simple载体中,构建克隆载体pMD-pLF。克隆的pLF基因片段全长2102bp,与GenBank上猪乳铁蛋白序列(登录号:L77887)的同源性达99%以上。对克隆载体pMD-pLF进行双酶切,将得到的2102bp长的pLF基因片段以正确的阅读框架定向克隆入含乙醇氧化酶启动子和分泌信号肽序列的Pichia pastoris表达载体pPICZαA中。通过电击法将经SacI酶切线性化的pPICZαA-pLF转化到毕赤酵母菌株GS115中,经Zeocin抗性浓度梯度筛选获得高抗性重组菌株,0.5%甲醇诱导表达。表达产物经TCA/DOC浓缩后进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,分泌于胞外的重组蛋白的分子量约为80kDa,与天然猪乳铁蛋白的分子量基本一致。Western-blot结果表明,表达产物可与猪乳铁蛋白抗体发生特异性反应。上述结果说明本试验成功实现了pLF在毕赤酵母系统中的分泌表达。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 史继静;刘朝奇;邹坤;杨祖伟;高明星;杨凡;;人IL-6/sIL-6R结合分子模型的建立及在药物筛选中的应用[J];中国生物工程杂志;2009年11期
2 H.C.VAIDYA ,D.N.DIETZLER ,J.H.LADENSON ,张利华;传统ELISA筛选杂交瘤上清鼠单克隆抗体的误差[J];细胞与分子免疫学杂志;1986年03期
3 Rode Pedersen ,李文琦;酶联免疫吸附法(ELISA)测定麻疹IgM[J];微生物学免疫学进展;1983年03期
4 贾然,林嘉友,邹明发,周彤,吴安然;用抗人IgE单克隆抗体测定人血清IgE(ELISA)[J];中国医学科学院学报;1985年03期
5 尚克刚,周迅蕾,吴鹤龄;北京鸭HMGs和HP_1的分离纯化及其对细胞核体外转录的影响[J];遗传学报;1988年01期
6 王正党;王林卿;张彦;彭克高;王嘉福;姜善镇;汪登荣;张武备;;仔猪副轮状病毒(C群)的检出[J];中国病毒学;1989年04期
7 杨同成;李田土;;赤小豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其性质研究[J];福建师范大学学报(自然科学版);1990年02期
8 王冬,宋桂经,高培基;芽孢杆菌O74碱性纤维素酶的纯化和性质研究[J];生物化学与生物物理进展;1994年03期
9 许鸣镝,柳雪枚;蜈蚣碱性蛋白SSmp-d的分离纯化及其部分理化性质的鉴定[J];中国生物化学与分子生物学报;1997年05期
10 李步海,武玉学,林爱华;淫羊藿中有效成分淫羊藿甙分离纯化的研究[J];中南民族学院学报(自然科学版);2001年04期
11 张希春,孙振钧,禚如朋,侯全民,林桂秋;蚯蚓两种抗菌肽的分离纯化及部分性质[J];生物化学与生物物理进展;2002年06期
12 王玉国,曾常茜,刘捷,金海甲,刘德新;尿液sIgA ELISA测定方法的建立[J];北华大学学报(自然科学版);2002年02期
13 韦世秀,舒雨雁,黎红烨;广西眼镜蛇毒磷酸二酯酶分离纯化及部分性质[J];中国生物化学与分子生物学报;2005年02期
14 王小东,毛慧玲,王顺启;真菌多糖的研究进展[J];江西科学;2005年03期
15 谢必峰,曹治云,郑腾,王水顺;黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性[J];应用与环境生物学报;2005年05期
16 米钰;代菊红;范代娣;童燕;韩娟;张炜;;重组类人胶原蛋白Ⅰ的层析分离[J];西北大学学报(自然科学版);2005年06期
17 韩宝芹;杨菊林;刘万顺;郝日光;;壳聚糖酶的分离纯化及性质研究[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2006年02期
18 张囡;王志友;张爱华;金玉玲;闭兰;赵亚杰;罗先凤;;抗SARS冠状病毒单克隆抗体的制备和鉴定[J];中国生物制品学杂志;2006年02期
19 刘晓华;万海清;;亚硫酸盐还原酶的分离纯化和酶学性质的研究[J];酿酒科技;2006年06期
20 黄键;王娟;陈必链;王明兹;梁世中;;紫球藻藻红蛋白的分离纯化及光谱学特性[J];植物资源与环境学报;2006年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 邢春莲;徐阳阳;赵蕊;杨一;崔立莉;曹健荣;;血筛产品(ELISA)检测能力的评价[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
2 刘辰庚;王培昌;;血清抗碳酸酐酶Ⅲ抗体ELISA检测方法的建立与初步应用[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
3 王凯;虞伟;高德玉;白彩琴;严孝岭;李晓军;;特异性ACPA免疫复合物ELISA检测法的建立及其应用[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
4 刘少宁;张兴晓;邹金峰;谢之景;朱岩丽;赵钦;周恩民;姜世金;;检测DuCV抗体ELISA方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
5 黄立平;刘长明;危艳武;陆月华;郭龙军;;检测猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
6 王丽;朱立苇;徐霄勤;杨雪梅;王拥军;吕杭军;;4项目复合ELISA室内质控品制备方法的建立和评估[A];中国输血协会第五届输血大会论文专集(摘要篇)[C];2010年
7 王辉;姚松涛;刘群;;检测弓形虫血清抗体的SPA-ELISA诊断方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
8 乔明明;申屠芬琴;马永缨;杨欣艳;杨璐;孙明;;猪瘟抗体间接ELISA检测试剂盒研究[A];中国畜牧兽医学会养猪学分会第五次全国会员代表大会暨养猪业创新发展论坛论文集[C];2010年
9 肖一红;吕军华;聂力;马晓春;周恩民;;高致病性与传统型PRRSV鉴别诊断间接ELISA方法的建立及初步应用[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
10 韩金乐;贾继宗;李川;杨亮;何德磊;李娟;叶祥忠;李益民;;肠道病毒71抗原ELISA定量检测方法构建及其应用[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 宋振梅;Clusterin在食管鳞癌中表达的研究与应用[D];山东大学;2005年
2 何继红;阿维菌素类药物多残留分析方法的研究[D];中国农业大学;2005年
3 陆志科;竹叶生物活性成分提取分离及其抗菌活性研究[D];中南林学院;2004年
4 徐金瑞;黑大豆种皮花色苷抗动脉粥样硬化及其抗氧化机制研究[D];西北农林科技大学;2006年
5 韩俊友;牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究[D];吉林大学;2007年
6 马春玲;海洋酵母普鲁兰类酵母碱性蛋白酶发酵生产、特性研究及基因克隆[D];中国海洋大学;2007年
7 陈杰;高密度培养盘基网柄菌及重组可溶性人Fas配体表达的研究[D];浙江大学;2008年
8 华颖;纤维蛋白溶解酶的发酵制备、分离纯化及酶学性质研究[D];江南大学;2008年
9 赵萍;家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂研究[D];西南大学;2008年
10 王元凤;茶多糖的分离纯化、结构及构效关系研究[D];江南大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 曹海军;猪乳铁蛋白的分离纯化及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达[D];南京农业大学;2008年
2 范秋佳;己烯雌酚人工抗原合成研究及ELISA检测方法的建立[D];河北农业大学;2010年
3 李子平;牛附红细胞体特异性抗原制备及双抗体夹心ELISA诊断方法的建立[D];中国农业科学院;2010年
4 尹衍新;基于CjaA蛋白检测鸡空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及其单克隆抗体研制[D];扬州大学;2010年
5 侯美如;牛轮状病毒的分离鉴定及其双抗体夹心ELISA方法建立[D];黑龙江八一农垦大学;2011年
6 赵刚;狂犬病病毒P蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立[D];湖南农业大学;2010年
7 文永平;鸭瘟病毒TK基因转录与表达时相及TK重组蛋白ELISA方法的建立和应用[D];四川农业大学;2010年
8 宋宇;魏氏梭菌α毒素基因的克隆表达及间接ELISA方法的初步研究[D];四川农业大学;2010年
9 王净;CPV VP2截短基因的克隆表达及双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用[D];中国农业科学院;2011年
10 武燕斌;汉赛巴尔通体P17基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立[D];内蒙古农业大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 马浩剑李昕;王柯:五年做到国内第一[N];常州日报;2007年
2 本报记者 何源;走近法国软件产业[N];电脑报;2003年
3 林诚;卡那霉素分离纯化新技术通过鉴定[N];医药经济报;2002年
4 ;PCC分离纯化工艺进展速览[N];中国医药报;2006年
5 王宏磊;中药苷类有效成分提取 辅料、工艺各不同[N];中国医药报;2006年
6 记者 王华锋;多数刺梨多糖组分具神经营养活性[N];中国医药报;2006年
7 林喆罗艳 原忠;分子印迹技术用于中药分离有据可依[N];中国医药报;2007年
8 本报记者 何聪;丰原:经济环境求双赢[N];人民日报;2005年
9 高彦生;OIE疫情专递[N];中国畜牧兽医报;2005年
10 金通证券 陈泳潮;科华生物 小盘成长 爆发填权[N];证券时报;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978