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芽胞杆菌发酵液中抗菌脂肽的定量检测方法及应用

艾嘉  
【摘要】: 抗菌肽(Antimicrobial Peptides)是生物体内经诱导产生的生物界中广泛存在的一类生物活性小肽,是两性分子,常带正电荷。根据来源不同,可分为动物体来源、植物体来源和微生物来源。抗菌脂肽是芽孢杆菌属产生的微生物来源的抗菌肽,具有抗细菌、真菌、病毒和支原体的功能,在抗菌的同时又不破坏动物体内的正常细胞,对人体安全,在生物医药方面具有重要的应用价值。此外,脂肽作为一种生物表面活性剂在石油工业、食品、化妆品和农业上有着广泛的应用价值。本文着重研究了抗菌脂肽的高效液相色谱定量检测方法,为抗菌脂肽的应用奠定基础。 本研究包括以下四方面内容: 1.用管碟法建立了青霉素效价的标准曲线Y=0.0057x+2.6048,相关系数达到0.9955。重复3次制作标准曲线,曲线间的相对标准偏差小于4%。以此标准曲线测定得1g抗菌脂肽粗样效价达到0.93×10~6IU。 2.建立了一种以高效液相色谱测定发酵液中表面活性素(surfactin)含量的新方法。采用COSMOSIL 5C_(18)-AR-Ⅱ(4.6×250mm)色谱柱,以乙腈(含0.1%三氟乙酸)和水(含0.1%三氟乙酸)为流动相,流速0.84mL/min梯度洗脱,210nm紫外检测,在20min内检测到surfactin。结果表明,运用本方法在1~100mg/L范围内surfactin浓度与积分面积之间具有良好的相关性(r=0.9998),精密度为1.5%,检出限为1mg/L,回收率达到96.59%。 3.自制了芬荠素(fengycin)相对纯品,并且建立了一种以高效液相色谱测定发酵液中fengycin含量的新方法。采用COSMOSIL 5C_(18)-Ms-Ⅱ(4.6×250mm)色谱柱,以乙腈(含0.1%三氟乙酸)和水(含0.1%三氟乙酸)为流动相,流速0.8mL/min梯度洗脱,230nm紫外检测,在30min内检测到fengycin。结果表明,运用本方法在5~300mg/L范围内fengycin浓度与积分面积之间具良好的相关性(r=0.9921),精密度为2.74%,检出限2 mg/L。 4.对抗菌脂肽的效价及应用作了研究。用双层琼脂法计算得1g抗菌脂肽粗样的效价达到1.1×10~6IU;以抗菌脂肽粗样配合山梨酸钾和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)对常温下酸奶的保鲜作用做了研究,结果表明,25℃条件下,以抗菌脂肽0.5g/kg、山梨酸钾0.2g/kg、EDTA0.13g/kg配比时能显著抑制酸奶中微生物的繁殖,使酸奶在常温下的保质期达到10d以上。


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