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具有高传播能力的栗疫菌低毒力病毒CHV1-CN280的基因组序列测定与可侵染性全长cDNA克隆构建

邓清超  
【摘要】: 栗疫菌细胞中的低毒力病毒是一类没有衣壳的双链RNA病毒,可以使寄主栗疫菌的毒力、分生孢子和色素的产量降低,并引起雌性不育。低毒力病毒的发现为栗疫病的生物防治提供了一种全新的思路。低毒力病毒缺少细胞外的传播途径,可以通过感染菌株与未感染菌株间的菌丝融合进行传播,但是这种传播受到营养体不亲和性的限制。 本研究通过在实验室条件下对3个CHV1低毒力病毒在栗疫菌各营养体亲和群菌株间的重复传播实验,量化分析了3个病毒在相差1-2个vic基因位点时传播效率的差异,首次直接证明了低毒力病毒CHV1在栗疫菌菌株间的水平传播受到病毒毒株的影响。结果表明,不同的CHV1低毒力病毒具有不同的水平传播能力,与其他两种已经测序并构建了全长可侵染性cDNA克隆的低毒力病毒CHV1-Euro7和CHV1-EP713相比,来自中国的CHV1-CN280具有最高的传播能力。而在国际上,之前的研究普遍认为关于低毒力病毒自身对其水平传播的没有影响。这一发现为选择高效果疫病生防病毒提供了新的指标,提示通过发现和使用传播能力更高的低毒力病毒,将会显著提高对栗疫病的生物防治效率。 通过逆转录构建cDNA文库并结合RT-PCR,对来自中国的低毒力病毒CHV1-CN280进行了基因组全长测序。CHV1-CN280的基因组全长12730bp(包括polyd(A)的26bp),序列分析表明,CHV1-CN280与已经测序的3个CHV1病毒在基因组上具有相似的结构。在核苷酸水平水平上CHV1-CN280和CHV1-Euro7有61-93%的序列同源性;与CHV1-EP713有60-90%的同源性。在氨基酸水平上CHV1-CN280和CHV1-Euro7有59-95%的同源性,与CHV1-EP713有61-94%的同源性。CHV1-CN280的3,端与已经测序的3个CHV1病毒同源性较高,但在5’端,CHV1-CN280与已经测序的3个CHV1病毒在核酸和蛋白序列上差异巨大。已经测序的4个低毒力病毒CHV1-EP713、CHV1-Euro7、CHV1-EP721和CHV2-NB58,在ORFA和ORFB之间都有一个UAAUG五核苷酸的连接区,其中AUG作为ORFB的起始密码子,UAA作为ORFA的终止密码子;而在CHV1-CN280中,ORFA和ORFB之间的连接区是AUGUAUAA八个核苷酸。设计了一对RT-PCR引物(A2275/B2915)对本实验室保存的12个CHV1病毒的ORFA和ORFB的连接区的序列测定表明,这种AUGUAUAA八核苷酸的连接方式和UAAUG五核苷酸的连接方式一样常见。设计了另一对RT-PCR引物(A364/B1402)用于测定本实验室保存的CHV1病毒的5'UTR和ORFA的部分序列以研究CHV1病毒的生物多样性。结果表明,所设计的引物在所有12个CHVl病毒的cDNA中都能很好的扩增出特异性的目标片段。结合本实验室在之前研究中对其他CHV1病毒的部分测序结果,对总共36个CHV1病毒进行了群体遗传分析。分析结果表明CHV1病毒具有复杂的遗传多样性,36个CHV1病毒可以被划分为包含8个亚型的2个群体,而之前已经测序的3个低毒力病毒CHV1-EP713、CHV1-Euro7和CHV1-EP721在系统发育树上聚集在一个很小的区域内。鉴于南方群体和北方群体间的巨大遗传差异,以及北方群体的CHV1-CN80与南方群体的CHV1-Euro7、CHV1-EP713和CHV1-EP721的全基因组序列比较结果,建议CHV1病毒应该划分为两个亚种(subspecies). 根据已经测序的低毒力病毒CHV1-CN280基因组全长cDNA序列信息,运用RT-PCR得到包含CHV1-CN280全部基因组序列的一系列cDNA片段的克隆,逐步通过酶切和连接,得到了CHV1-CN280全长12.7kb的cDNA克隆。体外转录成为单链RNA后在由电击转染栗疫菌原生质体,成功的在栗疫菌中再生出CHV1-CN280的病毒dsRNA,并表现出CHV1-CN280的一系列特性。CHV1-CN280感染不同宿主后表型相似,都和野生带毒菌株CN280表型一样菌体呈白色,可以产生少量分生抱子;在供体-受体菌株相差一个vic Aa基因时,再生出的CHV1-CN280病毒具有和野生CHV1-CN280病毒相似的传播能力,都显著高于CHV1-EP713. CHV1-CN280的侵染性克隆的获得,为进一步通过对CHV1-CN280、CHV1-Euro7和CHV1-EP713的区段互换,构建一些重组病毒来确定决定CHV1病毒水平播能力的关键位点、阐明CHV1-CN280高传播能力的分子生物学机制、设计和构建表型性状更好转基因生防工程菌株等研究打下了良好的基础。


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