三种激发子诱导的过敏性细胞死亡和气孔关闭的分子机制研究

【摘要】： 植物病原菌产生的激发子和病程相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)是一类重要的信号分子,模仿非亲和互作中植物与病原菌的信号交流,启动不同的级联信号途径,诱发植物的抗病性,导致过敏反应(hypersensitive response,HR)和气孔关闭。本研究采用病毒诱导基因沉默(virus inducing gene silencing, VIGS)技术研究了本氏烟(Nicotiana benthamiana)NADPH氧化酶(respiratory burst oxidase homologues, RBOH)、液泡加工酶(vacuolar processing enzyme, VPE)、异三聚体G蛋白(简称G蛋白)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)在不同来源的激发子(harpin、Nep1和boehmerin)诱发的过敏反应和气孔关闭中的功能,这些激发子分别是细菌(Xanthomonas oryzae)、真菌(Magnaporthe oryzae)和卵菌(Phytophthora boehmeriae)的PAMPs.试验证明(?)BOH、VPE和G蛋白参与3种激发子诱导的气孔关闭,MAPKKKa-MEK2-WIPK介导激发子Nep1诱发的HR,而Gα、Gβ2和VPEla参与harpin诱导的HR,表明不同激发子诱发的信号传导途径具有一定保守性,同时不同的激发子诱导的信号传导也存在特异性。 RBOH是最重要的活性氧(active oxygen species, AOS)来源之一。NbrbohA、NbrbohB单基因沉默,以及NrbohA和NbrbohB双基因沉默显著抑制了boehmerin、INF1和harpin等3种激发子诱发的叶片中H2O2积累,但不影响激发子诱导的HR,且基因沉默对激发子诱发的PR基因的转录没有影响；而这些基因沉默却抑制激发子诱导的气孔关闭,且保卫细胞内NO积累显著减少,但不影响保卫细胞内Ca2+浓度和AOS积累。说明RBOH参与激发子诱导的气孔关闭,但不参与激发子诱导的过敏反应和PR基因的转录；植物体内其它酶催化产生的AOS及AOS/NO平衡可能参与激发子诱发的过敏性细胞死亡。 VPE是植物液泡的半胱氨酸蛋白酶,具有类似动物caspases-1-like酶活性。本试验发现NbVPE1a和NbVPE1b单基因沉默,及NbVPE1a/1b双基因沉默不影响harpin、boehmerin和Nep1激发子诱发的H2O2积累,NbVPE1a和NbVPE1a/1b沉默却抑制了harpi(?)诱发的HR；而boehmerin和Nep1均可诱发这3种VPE沉默的植株产生正常的HR,表明harpir诱发的HR依赖于VPE,但是VPE不参与boehmerin和Nep1诱发的HR。单基因和双基因沉默均抑制3种激发子诱发的气孔关闭,且抑制了保卫细胞内NO的积累；3种激发子诱导处理后,单基因沉默植株叶片中保卫细胞内活性氧的积累与对照一致,但是双基因沉默植株中保卫细胞内AOS的量显著高于对照和单基因沉默植株中保卫细胞内AOS的量,表明双基因共同作用负调控保卫细胞内AOS的积累。进一步转录分析显示VPE调节了活性氧相关的基因(NbrbohB)和转录因子(WRKY2)的转录。而已证明气孔在植物免疫中具有重要功能,提示VPE参与PAMP触发的抗性(PAMP-triggered immunity,PTI). G蛋白连接着细胞表面的受体和下游的效应因子,在植物多种信号途径中具有重要的作用。本研究克隆了N.benthamiana G蛋白Gα、Gβ1和Gβ2等基因及腺苷酸环化酶基因(adenylyl cyclase,AC),Gα和Gβ2沉默抑制细菌蛋白激发子harpin诱导的过敏反应;Gα、Gβ2、AC削弱了3种激发子诱发的H2O2积累。Gα、Gβ1、Gβ2沉默抑制激发子诱发的气孔关闭,且保卫细胞中NO的积累减少。但是AC因沉默对3种激发子诱发过敏反应和气孔关闭及保卫细胞内NO的积累均没有影响。结果表明G蛋白的Gα、Gβ亚基在不同激发子激发过敏反应和气孔关闭及NO和H2O2积累中作用存在差异。 MAPK信号级联途径包含三个保守的激酶,MAPK kinase kinase(MAPKKK或MEKK)磷酸化MAPK kinase(MAPKK或MEK)又磷酸化MAPK,调节荷尔蒙和其它环境刺激或外源信号。MAPKKKα.MEK2和WIPK沉默烟草抑制了Nep1诱导的HR；MEK1、SIPK和NTF6沉默的本氏烟不影响harpin、Nep1和boehmerin诱导的HR.Nep1处理的基因沉默植株内,转录因子(WRKY2)和防卫基因(PR2b)的表达受抑制。WRKY2沉默后也抑制了Nep1诱导的HR,但不影响boehmerin和harpin诱导的HR。另外,MEK2-NTF6调节激发子诱导的H2O2积累；MEK2-WIPK调节Nep1诱导的NO积累,SIPK沉默削弱了激发子诱导的保卫细胞内NO积累。基因沉默烟草不影响激发子诱导的保卫细胞内Ca2+浓度和AOS积累。结果表明,MAPKKKα、MEK1、MEK2、WIPK、SIPK、NTF6和WRKY2参与调节激发子信号。综上,RBOH.VPE.G蛋白及MAPK调节激发子诱发的信号传递,揭示了不同激发子信号的保守性及复杂性。