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《南京农业大学》 2009年
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青枯劳尔氏菌PopW蛋白生物学特性及其抗病功能研究

李建刚  
【摘要】: 细菌性青枯病是一种由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solaanacearum, E F Smith)引起的毁灭性土传病害,发病植物茎叶萎蔫下垂直至全部枯死,是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一。青枯劳尔氏菌R. solaanacearum可侵染200多种植物,其中包括生产中重要的作物,如番茄、马铃薯、烟草、花生和香蕉。青枯病菌是一个复杂的群体,有明显的生理分化,不同地区和不同寄主来源的菌株,在寄主范围、致病力、生化型、血清型等细菌学特性上差异很大,因此增加了对此病害防治的难度。近几年来许多科研工作者从不同角度、用不同方法对青枯劳尔氏菌进行了多方面的研究。 Harpin蛋白是由革兰氏阴性植物病原细菌Hrp (hrp, hypersensitive response and pathogenity)基因簇中hrp基因编码的、性质和功能相似的一类蛋白质,富含甘氨酸,缺少半胱氨酸,对蛋白酶敏感,对热稳定,大多对寄主植物具有毒性,导致寄主发病,能在非寄主植物上引起过敏反应。 本研究以青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) ZJ3721的基因组DNA为模板,成功克隆了全长为1143bp的popW基因以及popW(1-159)和popW(160-366)两个基因片段,并把这三个基因连接到表达载体pET30a(+)进行了原核表达。在1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖昔的诱导下(IPTG),这三个基因都能在Escherichia coli BL21(DE3)中成功表达。通过对PopW表达条件的优化发现IPTG的最佳浓度为0.01 mM。运用镍柱纯化获得了高纯度的PopW融合蛋白。另外运用同源重组的方法我们还构建了青枯劳尔氏菌popW基因的插入突变体ZJ3722。 我们从青枯劳尔氏菌ZJ3721中鉴定了一个39.79 KDa的新胞外蛋白PopW,它同以前报道的harpin类物质具有相同的性质,酸性,富含甘氨酸和丝氨酸,缺少半胱氨酸并且是一种耐热蛋白。能在非寄主植物烟草上引起过敏性反应。在一级结构上,PopW是由两个结构域组成,包括N-末端159个氨基酸的harpin结构和C-末端207个氨基酸组成的果胶酶的结构域,他们之间由富含甘氨酸和丝氨酸的短肽连接起来。PopW的harpin结构域也能引起烟草发生HR反应。虽然PopW具有果胶酶结构域,但并没有果胶酶活性。另外,我们从其它十九个不同遗传多样性的青枯劳尔氏菌中都扩增到了popW基因,这说明popW是广泛存在于青枯劳尔氏菌的。把popW和绿色荧光蛋白(GFP)构成融合基因,连接至植物转基因载体pBI121,在土壤杆菌的介导下转入洋葱表皮细胞。荧光显微镜观察结果表明,PopW蛋白是定位在植物的细胞壁上。因此,我们推测PopW在青枯劳尔氏菌与寄主互作的过程中起帮助定殖的作用。通过popW的缺失突变体菌株的接种实验发现popW对非寄主植物烟草的HR反应和寄主植物的致病过程中不起决定作用。综上所述,PopW (39.79 KDa)是青枯劳尔氏菌中广泛存在的一个定位于寄主细胞壁上,受hrpB基因的调控,通过三型泌出系统分泌到胞外的且不影响菌株对寄主致病性的新harpin。 对青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) ZJ 3721中表达的PopW蛋白诱发烟草系统获得抗性进行了研究。以25 gg/mL PopW溶液处理三生烟草叶片24 h后,在处理叶片及其上、下各2片叶片接种TMV,结果显示处理叶及其上、下各2片叶片上的病斑数显著少于只接种水和TMV的对照叶片。同时PopW处理的烟草叶片中还伴随着H202的迸发,在处理后24h时,累积量达到了最大为1.972μM/gFW。另外在此过程中,烟草中还有防御酶系PAL,POD和PPO的时序变化,PAL酶活在12h达到了峰值1215.33U/g,POD和PPO在24h和10h到达了最大值,分别是1110.5U/g和863.67U/g。PopW还能诱导野生型烟草和拟南芥中PR-1基因的表达,而二者转nahG基因的突变体植株却没有该基因的表达。所以PopW能够诱导植物产生系统抗性,并且该抗性属于水杨酸介导的SAR。 茄子黄萎病是一种严重的土传维管束病害,本研究发现PopW蛋白能够诱导茄子产生抗性从而防止黄萎病菌的侵染。同时我们从353株茄子根围细菌中筛选到一株产几丁质酶的生防细菌CH2。根据16S rRNA基因序列和生理生化实验确定其为蜡状芽孢杆菌。它能在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长,经SDS-PAGE和特异性底物验证确定其可以向胞外为分泌15KDa的几丁质酶。通过平板实验我们发现,该菌的悬浮液、上清液及其产生的浓度为0.005%几丁质酶液可以有效的抑制黄萎病菌分生孢子的萌发。该菌产生几丁质酶的最适pH值是7.1,最佳温度为40℃。在温室试验中,CH2菌悬液的防效可达69.69%,25μg/mL的PopW蛋白溶液,CH2上清液及0.01%的几丁质酶液的防效分别为57.46%,54.04%和53.13%。所以CH2菌株具有很好的防治茄子黄萎病潜力。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S476

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